Фильтр косой грубой очистки: Фильтр косой Equation, 400-500 мкм, 1/2″

Кроме того, микроскоп был модифицирован для добавления дополнительных функций, таких как автоматическое получение изображений. Для этого на ручки осей микроскопа были установлены три шаговых двигателя, а для управления движением предметного столика микроскопа используется контроллер Arduino.

3.2.

Фильтры

Основная цель данной работы — изучить улучшение общего качества изображения, получаемого с помощью светофильтров. Для этого было разработано колесо фильтров, которое включает набор из семи фильтров (F2,…, F7) разной формы и область (F1) без фильтра. Колесо позволяет легко переключаться между фильтрами. Система фильтров показана на рис. 2. На рис. 2 (а) показана трехмерная (3-D) модель колеса.Процесс изготовления производился на 3-D принтере, что позволяет легко и дешево изготавливать фильтры. Для получения окончательного дизайна был произведен выбор между несколькими колесами. Наконец, после некоторых тестов восприятия, было выбрано уникальное колесо для проведения полного исследования, так как оно произвело наиболее значительное улучшение изображения. Распечатанное колесо показано на рис. 2 (б).

Рис. 2

Фильтровальная система. Метки 1, 2,…, 8 относятся к фильтрам F1, F2,…, F8. (а) трехмерная модель и (б) печатное колесо.

В микроскопе колесо фильтра расположено между источником света и конденсором (см. Рис. 3). На рис. 3 представлена ​​схема микроскопа и общий вид всей системы. В правой части рисунка указаны наиболее важные части оптического микроскопа. В левой части схемы графически показано, как работает этот светофильтр, изменяя направление света для получения различных уровней наклонного освещения в зависимости от формы фильтра.

Фиг.3

Схема микроскопа. В правой части указаны наиболее важные части оптического микроскопа, а также расположение колеса фильтра. Слева показан пример эффекта наклонного освещения, вызванного использованием этих фильтров.

3.3.

Набор данных

В этой работе был приобретен и оценен 21 таксон. Выбор видов был проведен специалистом по диатомовым водорослям, изучившим широкий спектр морфологических и структурных особенностей, таких как форма, размер и плотность штрихов, которые являются ключевыми факторами для идентификации таксонов.В Приложении A кратко излагается набор характеристик этих видов. Для каждого оцениваемого таксона было захвачено 20 полей, и каждое поле было получено с использованием восьми фильтров, показанных ранее в колесе фильтров, с учетом того, что фильтр 1 представляет собой нефильтрованное изображение (светлое поле). Таким образом, окончательный набор изображений состоял из 21 × 20 × 8 = 3360 изображений диатомей.

4.

Методология

4.1.

Получение изображения

После того, как виды были выбраны экспертом по диатомовым водорослям, поля были захвачены всеми фильтрами.На рис. 4 можно наблюдать поле диатомовых водорослей Cyclostephanos dubius с применением различных светофильтров. На рис. 5 показаны некоторые изображения, полученные для таксона Cocconeis placentula euglypta . Проверка качества этих изображений показывает различия с точки зрения разрешения, фокуса и контрастности. Таким образом, выполняется количественная оценка, чтобы определить влияние этих фильтров освещения с точки зрения качества изображения.

Рис. 4

Образец 1– Cyclostephanos dubius .(a) — (h) F1 — F8.

Рис. 5

Образец 2— Cocconeis placentula euglypta . (a) — (h) F1 — F8.

4.2.

Субъективная оценка

После того, как все 3360 изображений изучаемых таксонов были получены с помощью колеса фильтров, три систематика из Лаборатории диатомовых водорослей Экологической школы Университета де Леон (Испания) провели психофизический тест для качественной оценки их качества. Были проанализированы три свойства качества изображения и оценены от 1 до 5 (где 1 — очень плохое качество, а 5 — очень хорошее качество).Этими свойствами являются: (а) разрешение с точки зрения способности идентифицировать необходимые элементы диатомовых водорослей на изображении, (б) фокус, чтобы оценить размытость изображения, и (в) контраст.

После этого для каждого таксона и свойства была рассчитана гистограмма 160 полей, оцененных тремя систематиками. Чтобы определить значение качества для каждого фильтра, которое позволяет нам сравнивать их, выполняется линейная комбинация значений гистограммы, взвешенных со значениями оценок. Назначение веса представлено в таблице 2.На рисунке 6 показан пример результатов, полученных для таксона Nitzschia Umbonata при оценке трех свойств. В этом примере наилучшими фильтрами являются: (а) для разрешения — F2, за которым следует F3; (б) для фокуса — F2, за которым следует F5; и (c) для контраста — F3, за которым следует F6. В таблице 3 показаны значения гистограммы этого примера для лучших фильтров и окончательное значение, полученное после линейной комбинации.

Таблица 2

Вес, присвоенный каждой оценке.

Таблица 3

Значения гистограммы оценок Nitzschia Umbonata.

2 9011 9011 902 9011 902 902 902 902 9011 9011 9011 902 9011 902 9011

10

Рис.6

Nitzschia Umbonata оценка. F1 представляет нефильтрованное изображение, а от F2 до F8 — специально разработанные фильтры. (а) гистограмма разрешения, (б) гистограмма фокуса и (в) гистограмма контраста.

Таким образом, были рассчитаны лучшие фильтры для каждого таксона. Затем с учетом результатов анализа 21 таксона был построен сводный график. Гистограммы для каждого фильтра с учетом разрешения, фокуса и восприятия контраста приведены на рис. 7. То есть общее количество раз, когда фильтр выбирался как лучший или второй лучший.Наблюдая за этими результатами, можно увидеть, что с точки зрения: (а) разрешения фильтры F2, F3 и F6 обеспечивают лучший IQA, чем изображение без фильтра. Кроме того, для второго лучшего случая фильтры F3, F5 и F6 также выбирались чаще, чем F1; (b) фокусировка, фильтры F2 и F3 дают наилучшие результаты, и (c) контраст, только четыре фильтра были выбраны как лучший или второй лучший фильтр (F2, F3, F5 и F6), так что ни в коем случае улучшились ли результаты нефильтрованных изображений с точки зрения контраста.Другой важный вывод заключается в том, что некоторые фильтры не улучшают воспринимаемое качество изображения ни в одном аспекте, например F4, F7 или F8.

Рис. 7

Лучшие фильтры для субъективных метрик. F1 представляет нефильтрованное изображение, а от F2 до F8 — специально разработанные фильтры.

4.3.

Объективные показатели качества изображения

Результаты субъективной оценки показывают, что некоторые светофильтры улучшают качество изображения с точки зрения разрешения, фокуса и воспринимаемой контрастности.Чтобы количественно и объективно оценить качество изображения, тот же набор изображений был оценен с использованием семи безреференсных показателей IQA.

4.3.1.

Контрастность

Локальный контраст служит индикатором фокусировки изображения. ²⁵ Этот показатель основан на абсолютной разнице каждого пикселя с восемью соседними пикселями. Итоговая оценка рассчитывается сложением полученных значений для каждого пикселя

Eq. (1)

FContrast = ∑x∑yC (x, y). Значение контрастности C (x, y) для каждого пикселя I (x, y) рассчитывается, как описано как

Eq.(2)

C (x, y) = ∑i = x − 1x + 1∑j = y − 1y + 1 | I (x, y) −I (i, j) |.

4.3.2.

Энтропия гистограммы изображения

Энтропия — это статистическая мера информации, содержащейся в изображении. ²⁶ Этот показатель качества основан на том факте, что гистограмма сфокусированного изображения содержит больше информации, чем несфокусированная. Энтропию можно определить, как показано в уравнении. (3), где P (i) — вероятность для каждого уровня серого.

Ур. (3)

FEntropy = −∑intensityP (i) · log [P (i)].

Более четкие изображения имеют большее количество уровней серого, поэтому энтропия будет выше.

4.3.3.

Анизотропия

Анизотропия измеряется как дисперсия энтропии по нескольким направлениям. ²⁷ Как было объяснено ранее, энтропия увеличивается с увеличением резкости, но в ситуациях, когда изображения зашумлены, не существует справедливой корреляции. Таким образом, подход измерения анизотропии основан на том факте, что ухудшение изображения повреждает информацию о направлении, и по этой причине анизотропия уменьшается по мере добавления к изображению большего количества искажений.

Этот показатель чувствителен к шуму или размытости, поэтому его можно использовать в качестве хорошего метода IQA.

4.3.4.

Сумма модифицированного преобразования Лапласа

Эта основанная на производной метрика ²⁸ основана на операторе Лапласа [∇2I (x, y)] для оценки резкости изображения [I (x, y)]. Окончательная оценка показателя рассчитывается путем сложения результирующих абсолютных значений, полученных в процессе свертки [см. (4)], где Lx (x, y) и Ly (x, y) — изображения после свертки с оператором Лапласа

Eq.(4)

FSML = ∑x∑y | Lx (x, y) | + | Ly (x, y) |.

4.3.5.

Градиент Тененбаума

Этот метод, основанный на производных, является одним из первых показателей, предложенных для фокусного анализа в литературе. ²⁹ Он основан на операторах Собеля для свертки изображения (как вертикального, так и горизонтального). Окончательная оценка показателя рассчитывается как сумма квадратов компонентов вектора градиента [см. (5)], где Sx (x, y) и Sy (x, y) — изображения, полученные после свертки с операторами Собеля.Этот показатель предлагает общую меру качества изображения. ³⁰

Eq. (5)

FTenengrad = ∑x∑ySx (x, y) 2 + Sy (x, y) 2.

4.3.6.

Индекс качества слепого изображения

Этот показатель состоит из двухэтапной структуры для NR-IQA, основанной на статистике естественных сцен (NSS). ³¹ Методы NR-IQA обычно предполагают, что искажение, влияющее на изображение, известно, например белый шум, размытие по Гауссу или быстрое затухание. В метрике BIQI первым шагом двухэтапной структуры является классификация искажения изображения на основе того, как изменяются NSS, а вторым этапом является оценка качества с использованием определенного алгоритма для выбранного искажения.

4.3.7.

Оценщик качества естественного изображения

NIQE также является слепым методом NR-IQA, основанным на измеримых отклонениях от статистических закономерностей, наблюдаемых в естественных изображениях (построение модели NSS). Никакого обучения с искаженными изображениями, оцененными человеком, не требуется, что означает, что это «полностью слепой» показатель. ³² Окончательная оценка этого показателя, который дает меру качества анализируемого изображения, рассчитывается как расстояние между статистикой модели NSS и статистикой изображения.

5.

Результаты

5.1.

Объективные показатели качества

На рис. 8 представлены результаты объективных показателей качества изображения. Для каждой метрики вычисляются среднее значение и значения стандартного отклонения всех изображений для рассматриваемого фильтра. Полученные значения нормируются в интервале [0, 1]. Для всех показателей, за исключением BIQI и NIQE, более высокое значение означает лучшее качество изображения. Таким образом, во всех случаях значения для нефильтрованного изображения (F1) являются наименьшими, а более высокие значения обычно получаются фильтрами F3 и F6.Для двух последних проанализированных показателей, то есть BIQI и NIQE, результаты аналогичны, но представлены по-разному. В этих случаях более низкие значения означают лучшее качество изображения, а нефильтрованные изображения имеют более высокие оценки; следовательно, изображения, полученные с использованием светофильтра, имеют лучшее качество.

Рис. 8

Показатели объективных показателей качества. F1 представляет нефильтрованное изображение, а от F2 до F8 — специально разработанные фильтры. Красные квадраты и желтые точки указывают на лучший и худший результаты соответственно.(a) оценка контрастности, (b) оценка энтропии, (c) оценка анизотропии, (d) оценка SML, (e) оценка TG, (f) оценка BIQI и (g) оценка NIQE.

5.2.

Текстурные элементы

Чтобы изучить влияние использования этих фильтров наклонного освещения с точки зрения свойств текстуры, были рассчитаны некоторые статистические показатели Харалика ¹² и особенности Тамуры ¹³ . Результаты для контраста Харалика, энергии Харалика, однородности Харалика и грубости Тамура приведены здесь (см.рис.9). Оценка каждой характеристики нормализована в интервале [0, 1] и представляет собой среднее значение для всех проанализированных видов для каждого фильтра.

Рис. 9

Оценка текстурных особенностей. F1 представляет нефильтрованное изображение, а от F2 до F8 — специально разработанные фильтры. Красные квадраты и желтые точки указывают на лучший и худший результаты соответственно. (а) оценка контрастности по Харалику, (б) оценка однородности по Харалику, (в) оценка энергии по Харалику и (г) оценка грубости по Тамуре.

В случае контраста F1 [Рис.9 (a)], нефильтрованное изображение имеет наименьшее значение, поэтому использование фильтров освещения увеличивает общий контраст изображения, и, как правило, более высокий контраст связан с более резкими изображениями. И наоборот, результаты однородности по Харалику [Рис. 9 (b)] показывают, что нефильтрованное изображение имеет наивысшую оценку однородности. Этот показатель связан с предыдущим, потому что однородность изображения выше, когда контраст ниже. Следующие две меры, такие как энергия Харалика [рис. 9 (в)] и грубость по Тамуре [Рис.9 (г)], относятся к гладкой и грубой текстурам соответственно. В первом случае F1 имеет наибольшее значение; следовательно, изображение более гладкое, чем изображения, полученные с использованием светофильтра. В последнем случае F1 имеет самый низкий балл, что означает, что отфильтрованные изображения более грубые.

Мы можем использовать эти текстурные меры, чтобы связать визуальные свойства текстуры с качеством изображения. Таким образом, по сравнению с объективными показателями качества изображения, изображение с высокой контрастностью и более грубыми элементами текстуры будет иметь лучшее качество, чем другие с более низким контрастом и более мелкими элементами текстуры.

5.3.

Примеры

Анализируя результаты метрик IQA и текстурных мер, лучшими фильтрами являются F3 и F6, поскольку в большинстве случаев лучшие результаты были получены ими. Для визуального сравнения представлены два поля диатомовых водорослей на рис. 10 и 11. Различия в контрасте и разрешении можно наблюдать в обоих примерах, где показаны изображения F1 (без фильтра) и F3 и F6.

Рис. 10

Пример 1. Cymbella excisa .(а) F1 (без фильтра), (б) F3 и (в) F6.

Рис. 11

Пример 2. Navicula lanceolata. (а) F1 (без фильтра), (б) F3 и (в) F6.

6.

Выводы

В настоящем документе были протестированы различные фильтры наклонного освещения, чтобы проанализировать, повышается ли воспринимаемое качество изображения по сравнению со стандартным изображением в светлом поле. Для этого был разработан и изготовлен набор из семи фильтров различной внутренней формы с использованием трехмерного принтера.Было собрано двадцать образцов 21 вида диатомовых водорослей, которые оценили с помощью семи светофильтров в дополнение к нефильтрованному изображению. Полный набор данных (3360 изображений) был оценен группой из трех диатомов с точки зрения разрешения изображения, фокуса и контраста. Полученные результаты показывают, что фильтры наклонного освещения улучшают воспринимаемое разрешение изображения, и лучшими фильтрами для этих аспектов являются F2, F3 и F6. Однако по фокусу оценки, полученные для нефильтрованного изображения, очень похожи на лучшие (F2 и F3).Этот факт можно объяснить тем, что эти типы светофильтров добавляют эффект «тени» к воспринимаемым краям изображения, например искажение изображения. По контрасту лучшими фильтрами являются F2, F3 и F6.

Более того, тот же набор данных был оценен с использованием нескольких объективных показателей IQA без справочных материалов. Для всех из них изображения, полученные с использованием предложенных фильтров освещения, достигают лучших результатов, чем изображение, полученное без фильтра. Из семи проанализированных фильтров F3 и F6 получают лучшие оценки с точки зрения общего качества изображения.

Рассматривая результаты анализа текстуры и принимая во внимание объективные метрики оценки качества, мы можем определить связь между характеристиками текстуры и качеством изображения. Более грубые и более контрастные текстуры в изображении связаны с более высоким качеством, тогда как более мелкие, гладкие и менее контрастные текстуры связаны с более низким качеством изображения. В случае идентификации таксонов использование светофильтров увеличивает контраст, шероховатость и грубость изображения, и это воспринимается как лучшее качество изображения.

Следовательно, основываясь на полученных результатах, мы можем предположить, что использование этих типов недорогих светофильтров улучшает общее качество изображения при анализе диатомовых водорослей.

Приложения

Приложение А

На рис. 12 Рис. 13 Рис. 14–15 проиллюстрированы все классы диатомей, использованные в данной работе. Нефильтрованное (F1) исходное изображение отображается вместе с отфильтрованным изображением с наивысшим качеством, то есть F3, F6 и т. Д. Кроме того, указываются некоторые характеристики, такие как название таксона, средний размер и внешняя форма.

Рис. 12

Рис. 13

Рис. 14

Рис. 15

Раскрытие информации

У авторов нет соответствующих финансовых интересов в этой статье и нет потенциальных конфликтов интересов, которые следует раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают признательность Правительству Испании за финансовую поддержку проекта Aqualitas-retos (Ref. CTM2014-51907-C2-2-R-MINECO).

Ссылки

8.

Р. Нава, А. Гальего и Г. Кристобаль,
«Una nueva herramienta para la evalación de la calidad perceptible en imágenes»,

в Congreso Anual de la Sociedad Española de Ingeniera Biomédica CASEIB,
77
–80
(2006).Google ученый

17.

Д. Мерфи,
«Микроскопия с дифференциальным интерференционным контрастом (ДИК) и микроскопия с модуляционным контрастом»,
Основы световой микроскопии и электронной визуализации, 153
–168 John Wiley and Sons, Inc., Нью-Йорк
(2001). Google ученый

23.

W. Марк,
«Сочетание кругового косого и наклонного освещения для улучшения деталей и контраста в световой микроскопии»,
Современная микроскопия, 1
–10 The McCrone Group, Иллинойс
(2012).Google ученый

24.

Т. Кларк,
«Оценка прототипа конденсатора BF-DF-косо-кругового косого освещения (BF-DF-Obl-COL)»,
Современная микроскопия, 1
–10 The McCrone Group, Иллинойс
(2004). Google ученый

25.

Х. Нанда и Р. Катлер,
«Практическая калибровка цифровой всенаправленной камеры в реальном времени»,

в Техническом эскизе CVPR,
20
(2001). Google ученый

Биография

Хесус Руис-Сантакитерия получил степень компьютерного инженера в Университете Кастилья-Ла-Манча, Испания, в 2016 году.В настоящее время он учится на магистра компьютерной инженерии в том же университете и работает научным сотрудником группы VISILAB. Его текущие исследовательские интересы — искусственный интеллект, компьютерное зрение, обработка изображений и автоматизация в микроскопии.

Хосе Луис Эспиноза-Аранда получил степень компьютерной инженерии и докторскую степень в области компьютерных наук в Университете Кастилья-Ла-Манча, Испания, в 2009 и 2014 годах, соответственно. В настоящее время он является научным сотрудником группы VISILAB и адъюнкт-профессором Университета Кастилья-Ла-Манча, Испания.Его текущие исследовательские интересы включают искусственный интеллект и компьютерное зрение.

Оскар Дениз — доцент UCLM. Его исследовательские интересы в основном сосредоточены на компьютерном зрении и распознавании образов. Он является автором более 50 статей в журналах и на конференциях. Он является старшим членом IEEE. Он является координатором европейского проекта h320 «Eyes of Things» и участвует в проектах FP7 AIDPATH и h3020 BONSEYES. Рецензент / технический эксперт программ ЕС, таких как Eurostars, и член консультативного совета проекта h3020 TULIPP.

Карлос Санчес получил степень инженера-электрика в Автономном университете Мадрида, Испания, в 2014 году. В настоящее время он получает степень доктора философии в области промышленного машиностроения в Университете Кастилии Ла-Манча. Его диссертация разрабатывается в Instituto de Óptica (CSIC) под руководством Габриэля Кристобаля. В настоящее время его исследовательские интересы связаны с обработкой изображений микроскопии.

Мария Боррего-Рамос — морской биолог, специализирующийся на таксономии и систематике бентических диатомовых водорослей, а также оценке качества воды с использованием индексов на основе диатомовых водорослей.Соавтор восьми статей в международных журналах, индексируемых ISI. Интересуется управлением и охраной водных объектов.

Saul Blanco специализируется на таксономии, экологии и биогеографии пресноводных диатомовых водорослей, проведя несколько исследований по оценке качества воды с помощью индексов на основе диатомовых водорослей. В области систематики и биоразнообразия он открыл или совместно открыл более 20 новых для науки видов водорослей в разных регионах мира.Он является автором или соавтором восьми книг и двух глав в книгах. Он опубликовал ок. 100 статей в международных журналах, индексируемых ISI ( х = 22).

Габриэль Кристобаль в настоящее время работает научным сотрудником в Институте оптики (CSIC). Он был докторантом в Международном институте компьютерных наук и лаборатории электронных исследований (Калифорнийский университет в Беркли) с 1989 по 1992 год. Его текущие исследовательские интересы — совместное представление, моделирование зрения и обработка изображений в микроскопии.Он отвечал за несколько национальных и европейских научно-исследовательских проектов. Он был соредактором книг «Оптическая и цифровая обработка изображений» и «Биологически вдохновленное компьютерное зрение».

Глория Буэно — преподаватель и главный исследователь в Школе инженерии в UCLM в Сьюдад-Реале, Испания, с 2002 года, где она в настоящее время руководит группой VISILAB. Она имеет докторскую степень в области машинного зрения, полученную в Университете Ковентри в 1998 году. Она продолжала свою исследовательскую деятельность в различных исследовательских центрах, таких как Centro de Estudios e Investigaciones Técnicas de Guipuzkoa, Национальный центр научных исследований, Школа гражданского строительства и электросвязи Хопито, Univ.Луи Пастер, Гилберт Гилкс и Gordon Technology. Она возглавляет различные национальные и европейские исследовательские проекты в области обработки биомедицинских изображений. В настоящее время она занимается обработкой сигналов и изображений, моделированием и искусственным интеллектом.

Универсальный микроскоп наклонной плоскости для крупномасштабной визуализации субклеточной динамики с высоким разрешением

[Примечание редакции: авторы обжаловали первоначальное решение. Далее следует ответ авторов на первый раунд обзора.]

Рецензент № 1:

В этой рукописи авторы описывают развитие концепции однообъективного светового полотна с наклонной плоскостью. Общая идея состоит в том, чтобы создать двумерный световой лист с таким большим углом в образце, который может выдержать объектив. Световое поле излучения передается объективом и другой оптикой в ​​место на пути излучения, где плоскость освещения / излучения может быть отображена линзой с высокой числовой апертурой, которая наклонена к оптической оси.Это позволяет формировать на детекторе плоскость без наклона. Как описано во введении к статье, представленная здесь работа является развитием этой концепции. В более ранних конструкциях использовались объективы с более низкой числовой апертурой, чтобы «развернуть» изображение, и несколько ухудшались характеристики, так как не улавливался весь свет под самыми большими углами. В этой конструкции свет не теряется из-за компромиссов в NA. Это достигается за счет использования специально разработанного объектива, который по сути представляет собой иммерсионную стеклянную линзу, улучшающую числовую апертуру за счет более высокого показателя преломления.

Возможность использования стандартных клеточных препаратов, покровных стекол и оптики делает концепцию наклонной плоскости чрезвычайно практичной и действенной. Сообщаемое здесь улучшение является постепенным, но берет концепцию от некоторого компромисса NA к компромиссу без компромисса NA, поэтому неясно, почему установка с названием плоскости не будет использовать этот подход. Поэтому я думаю, что существует достаточное потенциальное влияние для публикации в eLife.

Учитывая, что влияние этой работы во многом зависит от ее способности создавать и использовать световые приборы для большего числа исследователей, авторам следует предоставить более практическую информацию по настройке и юстировке.Например, изображение в дополнительной информации о фактической реализации, основное руководство по выравниванию и вспомогательные оптические / механические части. Или, как минимум, объясните, как они получат это в руки пользователей / разработчиков.

Мы хотели бы поблагодарить рецензента за добрые слова, и мы рады, что они признают силу этого подхода и считают, что наш метод имеет достаточное влияние для публикации в eLife . Мы также согласны с тем, что предоставление практической информации о настройке и юстировке микроскопа было бы полезно.Таким образом, мы теперь предоставляем базовое руководство по настройке в Приложении 4. Кроме того, мы постарались сделать раздел «Материалы и методы» как можно более исчерпывающим, одновременно указывая потенциально заинтересованным читателям на онлайн-источники информации, которые включают полные списки деталей.

Центровка:

Теперь мы приводим в Приложении 4 раздел с советами и приемами по юстировке микроскопа.

Мы также работаем на общественных началах с Applied Scientific Instrumentation, чтобы они могли предоставить под ключ оптические компоненты для сборки микроскопа.

В материалах и методах «Установка лазерного сканирующего микроскопа», втором абзаце, последнем предложении, мы теперь указываем лицам на полный список деталей, предоставленный Millett-Sikking et al.

Мы работаем над размещением CAD-рендеринга микроскопа в Интернете, но эта работа еще не завершена. Тем не менее, если рецензент сочтет это критическим, мы заверяем вас, что мы завершим это до публикации рукописи.

Рецензент № 2:

В этой рукописи Фиолка и его сотрудники пытаются улучшить пространственное разрешение современных реализаций микроскопии освещения в наклонной плоскости (OPM) и применить свою технику для изображения субклеточной динамики в образцах отдельных клеток.Название рукописи вызвало у меня энтузиазм по поводу того, что авторы достигли технического прорыва в области световой флуоресцентной микроскопии (LSFM), но, к моему ужасу, мой энтузиазм сильно угас после внимательного прочтения их рукописи. Мало того, что авторам не удалось убедить меня в том, что они значительно улучшились по сравнению с ультрасовременным OPM, их данные и анализ не подтверждают их центральное требование о разрешении «в масштабе 200 нм». Здесь мало что продвигает световая микроскопия, и авторы, похоже, сознательно или случайно проигнорировали большой объем литературы, демонстрирующей реализации LSFM с более высокой эффективностью сбора и разрешением, чем то, что они заявляют здесь.Биологическое понимание в лучшем случае скудно, эксперименты представлены как «разовые» без какой-либо статистической строгости или попытки воспроизводимости. eLife просит нас оценивать рукописи, которые соответствуют «высочайшим научным стандартам и важны во всех областях жизни и биомедицинских наук», и эта статья не соответствует этой планке.

Мы ценим тщательный анализ рукописи рецензентом, а также их откровенную критику.

Разрешение: мы значительно улучшили наши измерения разрешения, и теперь они включают анализ декорреляции и анализ корреляции кольца Фурье как для гранул, так и для биологических данных до и после деконволюции.Мы также представляем необработанные данные и данные без деконволюции как для гранул, так и для клеток. Эти измерения еще раз подтверждают, что наш микроскоп обеспечивает разрешение, такое же или лучшее, чем у решеточной световой микроскопии для необработанных и неразвернутых данных (см. 10.1364 / OE.400164, 10.1038 / nature22369, 10.1364 / BOE.11.000008). Кроме того, теперь мы более четко показываем, что этот уровень разрешения может поддерживаться в большом поле зрения.

Литература

: Мы не намеревались «умышленно игнорировать» световые люминесцентные микроскопы с одним объективом, основанные на микрозеркалах, кантилеверах или «возбуждении под наклоном с боковой интерференцией», и мы исправили эту ошибку, обсудив эти методы во введении и сравнив наши исполнение им на протяжении всей рукописи.Из нашего анализа ясно, что многие из этих методов не могут конкурировать с полем зрения, возможностями объемной визуализации, разрешением, скоростью визуализации и практическим удобством использования, которые мы демонстрируем с помощью нашего метода.

Биология: Следует признать, что многие из биологических экспериментов, представленных в нашей рукописи, действительно являются «разовыми». Тем не менее, мы всего лишь просим, ​​чтобы рецензент придерживался того же стандарта, что и все другие разработки в области микроскопии, в том числе опубликованные в eLife (10.7554/ eLife .14472, 10.7554 / eLife .32671, 10.7554 / eLife .40805, 10.7554 / eLife .45919, 10.7554 / eLife .46249). Мы считаем несправедливым оговорить, что нам необходимо решить биологическую загадку, улучшив поле зрения в 3,7 раза и сопоставив разрешение решетчатой ​​световой микроскопии, метода, который является чрезвычайно сложным и несовместимым с некоторыми из полученных образцов. здесь. Теперь мы более систематически проанализировали стимуляцию PA-Rac1 и можем показать значительное увеличение скорости и продолжительности выпячивания по сравнению с контрольными клетками.

Статистическая строгость: это утверждение явно неверно, поскольку мы сообщаем количественные показатели диффузии цитозольных индикаторов, динамики выпячивания при оптической стимуляции Rac1 и оцениваем функцию распределения точек для большого количества шариков. Важно отметить, что каждое измерение сопровождается стандартными отклонениями или 95% доверительными интервалами. Что касается статистической надежности остальных биологических наблюдений, мы согласны с Yu et al. (10.7554 / eLife .46249), когда они заявляют, что «целью данной статьи была демонстрация технологии, а не проверка гипотезы, [поэтому] мы не определяли заранее какие-либо размеры выборки для этого исследования».

Научные стандарты: мы не только выполнили научные стандарты, обычно принятые в оптической микроскопии, но и превзошли их, скрупулезно предоставляя подробную информацию о сборе, обработке и анализе наших данных, а также делая общедоступными все данные и программное обеспечение. Исторически сложилось так, что нас наказывали за то, что мы не выполняли деконволюцию наших данных, а также за деконволюцию наших данных.В отличие от многих других рукописей, мы четко указываем разрешение наших необработанных данных и ограничиваем количество итераций Ричардсона-Люси, чтобы избежать вводящих в заблуждение результатов. В самом деле, мы ограничиваем повышение разрешения коэффициентом 2≈1,41, который многие специалисты в области сверхвысокого разрешения обычно принимают как теоретически приемлемый. Напротив, публикации, использующие решеточную световую микроскопию, регулярно деконволюционируют свои данные до тех пор, пока не добьются увеличения разрешения до 1,9 раза в осевом разрешении и с одним заметным исключением (10.1038 / nature22369) не раскрывают исходные значения разрешения (10.1364 / OE.400164., 10.1364 / BOE.11.000008).

Значение во всех областях жизни и биомедицинских наук: мы представили поистине универсальный микроскоп, который обеспечивает уникальное разрешение, поле зрения, скорость, субклеточную оптогенетику и возможность получать изображения невероятно разнообразной коллекции образцов, от отдельных клеток до целые ткани. Мы вежливо не согласны с вашим диагнозом, что он важен не для всех областей жизни и биомедицинских наук.

1) Получение изображений LSFM с одним объективом с высокой числовой апертурой не является чем-то новым, и опубликованные работы уже демонстрируют получение изображений с более высокой числовой апертурой с более высокой эффективностью сбора и разрешением, чем то, что сообщается здесь. Существует несколько работ, в которых достигается LSFM с линзами с высокой числовой апертурой и числовой апертурой> 1,1. Самый ранний, который мне удалось найти в моем обзоре литературы, — это Gebhardt et al., Опубликованный в 2013 году. Здесь отражающая поверхность в сочетании с целевыми значениями NA 1,35 и 1,40 NA использовалась для изучения связывания одиночных молекул фактора транскрипции в живых клетках млекопитающих.

Это классический документ из лаборатории Сунни Се, который представляет собой световой лист с диаскопического направления с водным иммерсионным объективом и отражающим кантилевером. Тем не менее, помещая образец в контакт с иммерсионным объективом и кантилевером, он больше не будет стерильным. Кроме того, образец должен находиться в непосредственной близости от наконечника кантилевера, что технически сложно и ограничивает поле зрения примерно 1/200 ^-9 того, что мы сообщаем для нашего OPM.Кроме того, световой лист не может достичь дна ячеек, так как покровное стекло может аберрировать его. Правильное использование микроскопа на основе АСМ также требует повторной калибровки для каждой ошибки изображения (см. Их методы). Возможно, наиболее важно то, что этот метод несовместим со многими образцами, которые мы визуализируем с помощью нашего OPM, включая микрофлюидные, тканевые срезы, нейроны и т. Д. Таким образом, хотя мы согласны с автором, что это демонстрация одиночного изображения с высокой числовой апертурой. объективный световой лист, ему не хватает общего удобства использования и производительности (поле зрения, объемной скорости визуализации), которые мы демонстрируем.Но сейчас мы включаем это в нашу рукопись.

Эта концепция была усовершенствована и упрощена в использовании в 2015 и 2016 годах Галландом и др. и Meddens et al., которые использовали отражающие микрожидкостные чипы для выполнения визуализации отдельных молекул различных образцов клеток и эмбрионов с высокой степенью обнаружения NA. Медденс использовал линзу с числовой апертурой 1,2, а Галланд — линзу с числовой апертурой 1,3, а Галланд особенно примечателен тем, что, слегка приподняв образец, можно получить изображение всего клеточного образца без клиппирования (в отличие от Гебхардта).Хотя ни Meddens, ни Galland не использовали масляный объектив 1,35 NA, это, по-видимому, тривиальная замена для их системы, и даже с их объективами объектива, о которых сообщают, я подозреваю, что поперечное пространственное разрешение улучшилось по сравнению с этой работой (подробнее об этом ниже). В частности, при чтении Галланда я был поражен концептуальным сходством и целями, изложенными в этой и этой рукописи: «Конфигурация soSPIM обеспечивает широкую модульность. Фазовое изображение, дифференциальный интерференционный контраст, формирование изображений с широким полем, высоким и сверхвысоким разрешением можно выполнять на одном микроскопе.Переключение оптического увеличения не требует перенастройки. Требование идеального механического совмещения двух объективов, используемых в традиционных SPIM, устраняется за счет использования одного объектива в сочетании с программно-управляемым выравниванием светового листа по оси зеркала. Долговременная стабильность повышается за счет использования одного объектива и возможности реализовать систему идеальной фокусировки, встроенную в инвертированные микроскопы ».

Galland, кажется, достигает многих заявленных целей этой техники.

Galland et al. используйте сложный микрофлюидный метод со встроенными микрозеркалами для освещения образца световой пластиной. Хотя мы согласны с тем, что смена объектива в этой системе тривиальна, фотолитография, последовательное анизотропное и сухое травление кремния и распыление золотых поверхностей для создания микрозеркала — нет. Кроме того, такая конструкция требует, чтобы образец помещался в микрополость, что опять же ограничивает типы образцов, которые могут быть отображены.Даже для агрегатов единичных клеток Galland et al. Пришлось собирать несколько изображений на плоскость изображения с помощью светового луча, расфокусированного на 20 микрон с помощью электропонастраиваемой линзы, а затем сшивать изображения вместе. Точно так же невозможно легко отобразить дно ячейки, так как световой лист будет искажен. Предоставляется очень мало информации о том, как они выполняли или анализировали свое разрешение, и приводится одно значение (565 нм) для ядерной пластинки. Хотя это может быть похоже на наше осевое разрешение при увеличении NA возбуждения, для правильной оценки предоставлено недостаточно информации, так как не предоставляется статистика.Для образцов размером более 28 микрон они должны существенно уменьшить освещенность NA. Таким образом, наш OPM гораздо более удобен для пользователя и способен отображать гораздо более разнообразные образцы.

Meddens et al. также используют сложный микрофлюидный метод со встроенным микрозеркалом, но их система освещения не имеет настраиваемой линзы. Кроме того, вместо того, чтобы иметь микрополости, Meddens et al. перетекают ячейки в микрожидкостный чип, что требует, чтобы образец преимущественно оседал в области, примыкающей к зеркалу.Также не предоставлено никакой информации об их разрешении в отсутствие изображения STORM. Таким образом, этот метод страдает многими из тех же недостатков, что и Galland et al. что касается разрешения, возможности изображения различных образцов, поля зрения, скорости и т. д. Действительно, из их изображений ясно, что наш метод OPM обеспечивает превосходные результаты визуализации.

А еще есть «LITE» микроскопия, опубликованная в JCB в 2018 году. Здесь используется наклонный световой лист (2,4 градуса по отношению к горизонтали) в сочетании с оптикой с высокой числовой апертурой, вплоть до числовой апертуры 1.49. Эта последняя NA обеспечивает получение изображений с более высоким разрешением, чем показанное здесь, что подтверждается изображениями шариков с FWHM <250 нм, до деконволюции.

Как позже отметили обозреватели, использование масляной иммерсионной линзы с высокой числовой апертурой приводит к значительным сферическим аберрациям, что обязательно приводит к зависящему от глубины боковому и осевому разрешению, а также к снижению чувствительности (из-за пониженного коэффициента Штреля). К счастью, хотя изменение объектива в такой системе тривиально, нужно спросить, почему они вообще не использовали иммерсионный объектив с водой или силиконом.К сожалению, это означает, что они могут конкурировать с нашей технологией только на стыке стекла. Как только они проникают в образец на несколько микрон, его характеристики заметно ухудшаются. Кроме того, чтобы покрыть поле зрения 150 микрон, они используют световой лист толщиной 4,3 микрона. Таким образом, их оптическое сечение также будет довольно плохим из-за большого количества нефокусного освещения и размытия изображения. По сути, это «широкое поле» со стороны. Для лучей освещения с более высокой числовой апертурой используемая фотомаска с четырьмя щелями приводит к периодической модуляции интенсивности вдоль оси распространения луча освещения, что делает ее неколичественной.Несмотря на то, что LITE довольно удобен, он требует специальных камер для визуализации и, следовательно, несовместим с разнообразным набором образцов, которые мы визуализировали (например, микрофлюидные, 96-луночные планшеты). В конечном счете, LITE в принципе способен отображать поле зрения такого же размера, как и мы, но с полной потерей возможности оптического сечения. Кроме того, ему не хватает скорости визуализации и универсальности, которые делают нашу систему мощной и действительно конкурентоспособной с точки зрения разрешения только в области, прилегающей к покровному стеклу.

Как и метод OPM, описанный в этой рукописи, все эти методы имеют свои недостатки — первые три требуют добавления зеркальных поверхностей для изгиба светового листа, а LITE, вероятно, страдает от расфокусированного освещения по полю зрения. и сферическая аберрация при использовании линзы 1,49 NA. Второй недостаток заключается в том, что ни один из этих методов не может легко достичь скорости методов, основанных на OPM.

Спасибо, полностью согласны.Мы обнаружили, что добавление зеркальной поверхности рядом с образцом резко ограничивает универсальность микроскопа и делает рутинное производство зеркальной поверхности или работу микроскопа довольно технически сложным. Мы согласны с тем, что эти методы необходимо обсудить, а их сильные и слабые стороны должны быть более подробно описаны.

Тем не менее, значительным преимуществом всех этих «истинных» однообъективных LSFM над работой авторов является доступ к полной числовой апертуре обнаруживающей линзы без внутренних потерь, которые возникают при использовании трех обнаруживающих объективов (71% световых потерь это огромная цена за систему, которая не обеспечивает полную числовую апертуру первичного объектива).Биолог, желающий получить максимальный сигнал и разрешение из своих тусклых образцов (например, как это часто делают одиночные молекулы или эндогенно-меченые конструкции CRISPR), вполне может воспользоваться преимуществами этих опубликованных методов, несмотря на их недостатки.

Эффективность сбора микроскопов сильно различается, и о ней редко сообщают. Например, эффективность сбора конфокального микроскопа одной молекулы может составлять всего ~ 3% (см. 10.1529 / biophysj.108.134346). Тем не менее, мы согласны с тем, что каждый жанр микроскопов занимает свою нишу. Если биологу нужен каждый фотон, мы бы порекомендовали микроскоп TIRF (и, возможно, HiLO или режим скользящего падения), потому что он сочетает в себе оптику с высокой числовой апертурой, 100% рабочий цикл освещения, оптическое сечение и обнаружение без аберраций. К сожалению, TIRF и HiLO не очень полезны для получения объемных изображений. Тем не менее, мы также не рекомендуем использовать изображения с сильно аберрированной PSF (например, LITE), так как это обязательно снизит их чувствительность.

Возможно, наиболее важным является то, что мы ясно продемонстрировали, что, несмотря на наши потери, мы можем получать изображения самых разных образцов с незначительным фотообесцвечиванием или фототоксичностью. Хотя мы не представляем данные, мы также выполнили визуализацию единичных молекул живых клеток генетически кодируемых флуоресцентных белков с помощью этого микроскопа. Эта чувствительность одной молекулы согласуется с бумагой eSPIM, а также с работой Сян Чжана (в которой на пути обнаружения используется поляризационный светоделитель, который автоматически отбрасывает 50% обнаруженного света без учета других потерь, 10.1038 / s41592-019-0510-z). Таким образом, мы считаем потери управляемыми, и мы также работаем над их сокращением (например, сокращение количества релейных линз, например, с помощью безлинзовых оптических методов сканирования).

Таким образом, почему ни одна из этих предшествующих работ не обсуждается в рукописи? Самое милосердное объяснение состоит в том, что авторы этой работы не знают об этом, но меня беспокоит, что в своих попытках «продать» свою нынешнюю технику авторы намеренно проигнорировали предыдущую работу.Интеллектуально честное сравнение их метода по сравнению с этими другими методами с более высокой числовой апертурой улучшило бы эту работу — в частности, утверждение, что они достигают «наивысшего латерального разрешения в световой микроскопии», казалось бы совершенно ложным, основываясь на этих предшествующих методах работы LSFM. при более высоком NA.

Как упоминалось ранее, теперь мы обсуждаем эту литературу в рукописи. Мы не намеренно игнорировали эти статьи, чтобы «продать» нашу рукопись. Предполагать, что мы проигнорируем часть литературы в попытке продвинуть нашу собственную науку за счет наших коллег, оскорбительно.Напротив, это была искренняя ошибка суждения. Когда мы писали эту рукопись, мы были сосредоточены на решеточной световой микроскопии, которая многими воспринимается как доминирующий и самый совершенный световой микроскоп для получения изображений с высоким разрешением. В то время как рецензент прав в том, что микроскопы с одним объективом и линзами с высокой числовой апертурой обладают потенциалом превзойти разрешающую способность решетчатого светового прибора, решетка гораздо более универсальна в диапазоне исследуемых образцов. Таким образом, мы были слишком узко сфокусированы на решеточной световой микроскопии как главном конкуренте.

Кроме того, мы допустили семантическую ошибку, назвав наш микроскоп для наклонной плоскости световым микроскопом с одним объективом. Тем не менее, мы не считаем эти методы конкурентоспособными с точки зрения технических характеристик прибора (опять же, разнообразия образцов, скорости, поля зрения, оптогенетики…) по сравнению с нашим микроскопом для наклонной плоскости. Мы согласны с тем, что срок наивысшего разрешения на данный момент не оправдан, и соответственно уменьшили количество претензий по разрешению.

2) Заявления о разрешении не подтверждаются данными и не показывают значительного прогресса по сравнению с предыдущей работой.

a) Авторы заявляют о «разрешении по горизонтали в масштабе 200 нм». Их единственным доказательством этого утверждения, по-видимому, являются изображения бусин размером 100 нм, которые они деконволюционировали с помощью алгоритма Ричардсона-Люси. Использование RL на бусинах в качестве метрики исключительного разрешения в лучшем случае наивно, а в худшем — вводит в заблуждение и неверно. Известно, что RL превращает шарики в точки, т.е. независимо от физических ограничений оптической системы можно требовать произвольно хорошего разрешения, если выполнить чрезмерную деконволюцию. Как определялось количество итераций и почему не показаны кривые сходимости? Цифры, представленные авторами, вызывают и другие опасения —

.

Теперь мы предоставляем ортогональные меры разрешающей способности прибора, включая анализ декорреляции и анализ корреляции кольца Фурье, и они в значительной степени согласуются с предыдущими измерениями.Важно отметить, что мы сообщаем эти значения для необработанных и деконволютированных объектов, включая бусинки и внутриклеточные мишени. Тем не менее, мы также хотели бы заявить, что большое количество статей по микроскопии сообщают о значениях разрешения RL после деконволюции (например, Lattice, iSIM, ISM, diSPIM,…).

RL: Хотя мы согласны с тем, что деконволюция RL может привести к нереалистичным значениям разрешения для точечных источников, мы четко заявляем в рукописи, что выполняем минимальное количество необходимых итераций (всегда меньше 20) для достижения 2≈1.41 увеличение разрешения, которое считается приемлемым в области сверхвысокого разрешения в зависимости от ситуации (т.е. iSIM, ISM и другие методы конфокального переназначения фотонов требуют двукратного улучшения разрешения, где улучшение в два раза физически происходит из-за небольших отверстий, а другое 2 происходит от итеративной деконволюции. Если бы их разрешение с помощью итеративной деконволюции было незаконным, это, по сути, вывело бы их из поля сверхвысокого разрешения). И коэффициент усиления 1,41 значительно меньше, чем у других в этой области, включая ~ 1.9 улучшений осевого разрешения в решетчатой ​​световой микроскопии. Кроме того, мы выполнили анализ сходимости, но не представили данные в этой рукописи, поскольку они не столь четкие, как мы надеялись (см. Изображение ответа автора 1, осевое разрешение начало выравниваться после 15 итераций, но латеральное разрешение все еще уменьшалось). Таким образом, мы использовали эмпирический квадратный корень из двух критериев, что нередко в области микроскопии. Но, что важно, мы также предоставляем необработанные данные, чтобы читатель мог четко судить, что происходит от необработанной производительности, а сколько от деконволюции.

Тем не менее, мы с пониманием относимся к проблемам с деконволюцией, и мы сократили свои требования на основе деконволюционных значений, согласно оценке FRC и анализа декорреляции изображений. Теперь мы акцентируем внимание на характеристиках по всему полю зрения, которое, на наш взгляд, впечатляюще однородно. Это более ценное преимущество нашего микроскопа, чем увеличение разрешения в диапазоне десятков нм.

б) Авторы развернули свои бусинки до тех пор, пока они не достигнут значения 189 +/- 6 нм. Частота отсечки для линз, которые они используют, при условии света 500 нм, составляет λ / (2 * NA) = 500 нм / (2 * 1,35) = 185 нм. На первый взгляд, деконволюционные числа предполагают, в лучшем случае, что авторы достигают числовой оценки, очень близкой к 1,35. Действительно, количество, которое они сообщают, заставляет меня задаться вопросом, просто ли они деконволюционировали свои данные, пока не приблизились к этому теоретическому значению. К сожалению, их собственные необработанные измерения говорят об обратном, поскольку для тех же гранул в режиме широкого поля (без обнаружения OPM) они сообщают о ~ 240 нм на полуширине.Предполагая, что в этой основной линзе нет дополнительных аберраций, а ~ 240 нм соответствует полной числовой апертуре 1,35, в режиме OPM авторы относительно далеки от достижения характеристик, ограниченных дифракцией — они сообщают о боковых значениях FWHM 284 x 328 нм в поперечном направлении. Конфигурация OPM. Учитывая, что разрешение масштабируется с числовой апертурой, эти числа предполагают (в лучшем случае) числовую апертуру 1,35 (240/284) = 1,14 в направлении, перпендикулярном сканированию, и числовую апертуру 1,35 (240/328) = 0,99 в направлении вдоль изображения. сканирование. Комбинация, похоже, не лучше (или незначительно), чем то, что достигается в решеточной световой микроскопии с 1.1 линза NA.

Хорошо известно, что дифракционный предел Аббе является оптимистической оценкой для разрешения, и реальные системы визуализации с высокой числовой апертурой достигают разрешения на ~ 20% меньше из-за многих факторов (коэффициент Штреля <1, затухание маргинальных лучей, функция передачи модуляции, так далее.). Таким образом, мы не согласны с оценками эффективного NA, основанными исключительно на достигнутом разрешении. Если мы аналитически вычислим используемый нами полуугол раскрытия, эффективная числовая апертура для обнаружения будет равна 1.28 (Приложение 3). Мы согласны с тем, что наши измерения хуже в формате микроскопа наклонной плоскости. Мы заметили, что если мы наклоним тракт третичной визуализации до нулевого градуса, разрешение необработанного изображения в поперечном направлении будет равномерно ~ 270 нм, что больше соответствует расчетной числовой апертуре. Это после прохождения большого количества линз, которые подтверждают правильность базовой оптической конфигурации и юстировки. Тем не менее, это также показывает, что наклон третичной системы формирования изображения вызывает некоторую потерю остаточного разрешения, и оговаривает, что более низкие углы наклона могут быть более предпочтительными для достижения наивысшего разрешения.Мы обсудим эти компромиссы более подробно в Приложении 2.

Однако мы согласны с утверждением, что практическое разрешение, которого мы достигаем, не является драматическим: анализ на основе Фурье показывает наше латеральное разрешение на уровне 220 ± 23 нм (FRC) и 251 ± 3 нм (декорреляция изображения) для деконволюционных биологических данных, решетчатого света. Листовая микроскопия сообщает о значении поперечного разрешения 250 нм. Тем не менее, тот факт, что можно получить аналогичную или даже лучшую производительность с одной основной линзой, что обеспечивает большую гибкость при установке образца, является важным и замечательным открытием, которое позволяет нам снимать гораздо более разнообразный набор образцов.Наконец, мы замечаем, что, несмотря на наши усилия по разблокированию еще более высокого разрешения в OPM, одинаково выгодно увеличивать поле зрения и однородность разрешения, поскольку это позволяет увеличить пропускную способность изображения. Мы можем покрыть 180×180 микрон с довольно равномерным разрешением, что после пересмотра будет более ценным, чем споры о приросте разрешения +/- 10 нм. Таким образом, мы снизили акцент на некоторых наших требованиях к резолюции и переместили некоторое внимание в сторону поля зрения. Примечательно, что в решеточной световой микроскопии используется детекторная линза, которая не корректируется для видимого диапазона, и не используется надлежащая трубчатая линза, что ограничивает ее полезное поле зрения.

c) Авторы утверждают, что OPM занимает уникальную нишу среди LSFM благодаря своей способности легко интегрироваться в существующие рабочие процессы оптической микроскопии. Я с пониманием отношусь к этому аргументу, но не уверен, что описанная здесь методика является концептуально новой или даже выгодной по сравнению с предыдущим современным уровнем техники в этой области: Янгом и др. 5. Как правильно указывают авторы, концептуальный прогресс, реализованный Янгом, заключается в том, что вставка куска материала с высоким показателем преломления между вторичными и третичными линзами обеспечивает лучшую производительность, чем предыдущие OPM.Использование индивидуальной цели вместо неудобной конструкции покровное стекло / вода, используемой в Yang, определенно является шагом в правильном направлении к тому, чтобы сделать метод более практичным и коммерчески жизнеспособным, но не является концептуальным достижением. Вдобавок к этому Ян сообщает о значениях FWHM на основе гранул до деконволюции: 316 ± 8 нм, 339 ± 18 нм в латеральном направлении и 596 ± 32 нм в осевом направлении. Поперечные значения примерно на 10% хуже, чем указанные здесь, что достаточно близко, чтобы мне очень трудно поверить в то, что работа авторов представляет собой заметный прогресс по сравнению с предыдущей работой Янга и др.то есть незначительное улучшение, о котором они сообщают в значениях FWHM до деконволюции, вряд ли будет иметь какое-либо качественное значение для типа данных / понимания, полученного в отношении этой ранее опубликованной статьи, а также не оправдывает количественный скачок от «масштаба 300 нм» до «200 нм». шкала». Более того, осевое значение FWHM, указанное в Yang, на ~ 25% лучше, чем указанное здесь число 823 ± 31 нм. Взятые вместе, эти сравнения предполагают, что эта работа представляет собой поворот в пространстве параметров, а не прогресс.

Мы хорошо знакомы с eSPIM (Бинь Ян также является соавтором этой рукописи), и мы считаем, что наша рукопись является большим достижением в том, чтобы сделать дизайн eSPIM рутинно полезным для гораздо более широкого режима образцов. Действительно, наше поле зрения в 3,7 раза больше, чем у eSPIM, благодаря чему система превращается из специализированной системы визуализации отдельных клеток в систему, способную работать с нейронами, эмбрионами и даже тканями. Мы также представляем первый оптогенетический модуль, который обеспечивает уровень контроля, необходимый для стимуляции клеток произвольным 2D-паттерном синхронно с объемной визуализацией.Хотя наше разрешение одинаково, наш путь обнаружения намного более апохроматичен, а наше выравнивание гораздо более надежно. Мы также можем отображать глубже образца благодаря большему рабочему расстоянию основного объектива. Теперь мы подробно описываем все преимущества нашей системы и eSPIM в вспомогательной записке 1.

В первоначальной рукописи мы не акцентировали внимание на осевом разрешении и использовали довольно низкую настройку числовой апертуры, которая подходила бы для самых разных образцов. Однако для исследования возможных осевых разрешений мы систематически меняли эффективную числовую апертуру возбуждения.Мы можем достичь того же аксиального необработанного разрешения, что и в работе Бин Янга, с использованием гауссова луча, хотя мы отмечаем, что этот режим лучше всего подходит для неглубоких, прикрепленных клеток (применяется как к eSPIM, так и к нашей работе).

d) Возможно, наиболее примечательно то, что авторы не пытаются проверить «масштаб 200 нм» ни на одном из своих изображений, например путем эмпирического исследования, могут ли они разделить биологические особенности на таком расстоянии, или с помощью методов на основе Фурье, которые обеспечивают карты разрешения на основе пикселей6,7. Это будет иметь большое значение для выяснения того, действительно ли они достигли разрешения «в масштабе 200 нм» по сравнению счто-то вроде разрешения «в масштабе 250 нм» или даже «в масштабе 300 нм» в биологических образцах. В идеале эти вычисления должны выполняться с деконволюцией и без нее, чтобы эффект деконволюции был четко отделен от «сырых» характеристик визуализации. Говоря о сырой производительности, мне непонятно, какие из представленных данных деконволюционированы, а какие необработанные. Представляют ли авторы где-нибудь в этой статье какие-либо необработанные данные? Этот момент требует уточнения.

В данной области принято считать, что тщательный анализ субдифракционных шариков является лучшим методом оценки характеристик прибора.Оценка биологических целей, для которых не существует достоверной информации, потенциально проблематична. Тем не менее, теперь мы предоставляем анализ на основе Фурье (FRC и анализ декорреляции изображений) разрешения прибора с деконволюцией и без нее на биологическом образце. Мы также теперь предоставляем изображения бусинок до и после деконволюции (Рисунок 2), а также недеконволюционное изображение ER и эмбриона Drosophila (Рисунок 3 — приложение к рисунку 1 и рисунок 8 — приложение к рисунку 1.). Мы также показываем оптогенетические данные в необработанном виде, включая виды сверху и в разрезе.Мы также четко указываем, какие данные являются необработанными, а какие — в развернутой форме в таблице в дополнительном файле 1.

e) Каков размер пикселя в результате работы системы визуализации и представленных здесь данных? Вызывает беспокойство то, что все данные, за исключением бусинок, по крайней мере, были отображены в вокселях 115 x 115 x 100 нм. Один только Найквист сказал бы, что разрешение по горизонтали в масштабе 200 нм невозможно.

Первые два измерения в вокселе (115 нм) физически задаются увеличением оптической последовательности.Третье измерение (100 нм) задается размером шага лазерного сканирования. В этой рукописи мы, Найквист, отобрали образцы в соответствии с нашим исходным разрешением. Для деконволюции данные о шариках и биологические данные, в которых разрешение было количественно определено, были интерполированы на более мелкую сетку перед деконволюцией. Без повторной выборки максимальное разрешение (т.е. там, где достигается критическая выборка Найквиста) составляет 230 нм. Мы не проводили повторную выборку большинства биологических данных перед деконволюцией, потому что их огромный размер стал бы ограничивающим.Термин «разрешение масштаба 200 нм» был удален из рукописи.

3) Значения осевого разрешения, о которых сообщают авторы, значительно хуже, чем у современных многоракурсных методов LSFM8-11, которые могут достигать почти двукратного увеличения осевого разрешения по сравнению с их (вероятно) чрезмерно оптимистичными деконволютированными значениями 570 нм. Эти ссылки должны быть процитированы, поскольку они устанавливают планку осевого разрешения, а не решетчатую систему световых листов. Говоря об осевом разрешении, почему осевая FWHM не указывается в дополнение к боковым измерениям FWHM на рис. 2 — приложение к рис. 5? Пожалуйста, предоставьте все измерения XYZ перед деконволюцией, чтобы «сырые» значения FWHM были очевидны для заинтересованного читателя.Это поможет избежать путаницы в отношении вероятной чрезмерно агрессивной деконволюции.

Мы не оптимизировали осевое разрешение в первой версии рукописи, а использовали световой лист с низкой числовой апертурой для покрытия большинства образцов. Если мы увеличим числовую апертуру светового листа, мы достигнем необработанного осевого разрешения 587 ± 18 нм, что соответствует eSPIM, и лучшего значения необработанного разрешения, чем когда-либо сообщалось для широко используемого решетчатого светового микроскопа (в наиболее часто используемых режим квадратной решетки).Теперь мы сообщаем об аксиальном необработанном разрешении для различных настроек светового листа. Мы считаем, что эти значения конкурентоспособны с основным другим методом, используемым для изображения таких образцов, представленным в рукописи, — решетчатым световым микроскопом.

Мы представили на рисунке 1 необработанные измерения XYZ на FWHM, а также деконволюционные значения. На новом рисунке 2 мы теперь также предоставляем необработанные значения разрешения XYZ по полю обзора и дополняем их измерением декорреляции изображения.Кроме того, мы сообщаем об анализе FRC и декорреляции изображения для бокового разрешения до и после деконволюции. Я думаю, что это гораздо более актуально, чем многие другие рукописи, включая методы Multiview LSFM, которые сообщают только о разрешении после итеративной деконволюции. Мы полагаем, что читатель может получить четкое представление о том, сколько можно получить в исходном разрешении с нашей установкой, и что дает деконволюция. Мы чувствуем, что были открыты и прозрачны в отношении наших значений разрешения, гораздо больше, чем любая другая публикация в области световых листов, о которой мы знаем.

Несмотря на то, что методы многовидового обзора действительно обеспечивают отличное осевое разрешение, по крайней мере два объектива должны взаимодействовать с образцом. В этой рукописи явная цель состоит в том, чтобы иметь только одну цель, взаимодействующую с образцом, чтобы обеспечить более широкое применение различных образцов. Вы просто не можете поместить многолуночный планшет или другие громоздкие держатели образцов в миллиметровый объем образца многовидового микроскопа.

Теперь мы явно упоминаем многоракурсные методы в Обсуждении: «В дополнение к простоте использования OPM, описанный здесь, обеспечивает пространственное разрешение, которое не уступает решетчатой ​​световой микроскопии, хотя и с большим полем обзора и более быстрым волюметрическим анализом. емкость изображения.И в отличие от современных многоракурсных методов LSFM, которые обеспечивают немного лучшее осевое разрешение, требуется только одна перспектива изображения ».

Стоит упомянуть, что эти методы многоракурсного LSFM требуют того же алгоритма RL для слияния изображений, что является здесь источником большого беспокойства. Например:

Wu et al. (10.1038 / nbt.2713) — сходится после 30 итераций.

Guo et al. (10.1038 / s41587-020-0560-x) — Новый задний проектор, сходящийся примерно за 10 итераций.

Wu et al. (10.1038 / s41467-017-01250-8) — Геометрия отражающего изображения, укажите от 20 до 100 итераций RL в дополнительном файле 3.

Рецензент № 3:

Авторы сообщают об одном микроскопе со световым листом (SOLS), который обеспечивает беспрецедентную числовую апертуру для визуализации светового листа. В микроскопе используется недавно доступный твердотельный иммерсионный объектив для повторного изображения правильно переданной наклонной плоскости изображения на камеру при кодировании информации с высокой числовой апертурой под меньшими углами луча, что позволяет получать их без стерических помех между парой удаленных объективов.Это является естественным развитием eSPIM (Yang et al., 2019), который впервые продемонстрировал использование сжатия лучей в SOLS. Применение этой технологии к нескольким приложениям, которые в противном случае были бы чрезвычайно сложными в контексте светового листа / визуализации в реальном времени, иллюстрируют, что микроскоп может отображать традиционные препараты образцов, в микрожидкостных чипах и с высокой скоростью объемного изображения. Эти приложения представляют собой подходящую демонстрацию технологии и многообещающие пути для дальнейших исследований без предоставления существенных биологических выводов.Учитывая технологическую направленность статьи, я считаю, что статья тем не менее заслуживает публикации в eLife, когда будут решены указанные ниже проблемы. В целом, я считаю, что эта работа и недавние разработки, на которых она основана, будут иметь огромное значение для сообщества специалистов по клеточной биологии в ближайшие годы.

Перед публикацией необходимо рассмотреть следующие основные моменты:

1) Сказав, что это технологически ориентированная статья, по крайней мере, с точки зрения новаторства в подходе, я на самом деле почувствовал, что в этой статье не хватает статьи.Я знаю, что большая часть разработок, связанных с целью твердого погружения, сообщается из источников, не прошедших экспертную оценку (GitHub и т. Д.). Однако, поскольку это первое рецензируемое исследование с использованием этой технологии, более подробное описание системы, тем не менее, представляется оправданным, особенно в отношении оптического моделирования, аберраций / полезного поля обзора (например, сравнения моделирования с наблюдениями) и обсуждения различные компромиссы и т.д.У авторов есть уникальные возможности для предоставления этой информации.

Мы согласны с тем, что более подробное описание твердотельной иммерсионной цели было бы полезно. Мы подробно описали некоторые варианты дизайна и их последствия в Приложениях 1-3. Однако в духе поддержки открытых научных идеалов Эндрю Йорка и Альфреда Миллетт-Сиккинга (которые, по нашему мнению, хорошо согласуются с миссией eLife ), мы согласились позволить им хранить многие из этих деталей на своем GitHub. страницу и процитировать ее как материалы, предоставленные Zenodo.Дополнительные сложности возникают из-за неразглашения служебной информации (которую не знают даже соответствующие авторы) относительно третичной цели в соответствии с соглашением между Calico, ASI и Special Optics. Тем не менее, теперь мы приводим перечень этих различий в Приложении 1.

2) Авторы включают несколько сравнений с решеточной световой микроскопией, которые могут быть лучше подтверждены соответствующими данными и расширенным обсуждением. Это отмечено в комментариях ниже.Точно так же я считаю, что авторы уникально могут предоставить дополнительную информацию с помощью моделирования и данных, которые, вероятно, уже существуют, например Измерения PSF флуоресцентных шариков (например, Chang et al., 2019). Авторам также было бы полезно сравнить с некоторыми другими отчетами по световой микроскопии высокого разрешения, например Бесселев пучок (одно / двухфотонное возбуждение, микроскопия световых листов с осевой разверткой).

Рецензент прав в том, что мы уникально приспособлены для предоставления этих данных, но хотел отметить, что наша работа по синтезу полей была выполнена с парой значений NA 0.Объективы 8 / 40X, а не гораздо более дорогие объективы, использованные в оригинальной рукописи на решетке. Таким образом, сравнение нашей NA 1,35 и NA 0,8 было бы нечестным. Кроме того, проведение такого тщательного анализа — задача не из легких, особенно во время пандемии. Тем не менее, мы твердо уверены, что, предоставляя необработанные и деконволюционные данные для каждой опубликованной нами методики микроскопа, мы оставили читателям более прозрачный способ сравнения оптических характеристик различных микроскопов.Необработанная информация о разрешении полностью отсутствует в оригинальных публикациях по световым листам на решетке, и мы надеемся, что недавней публикации из нашей лаборатории (Chang et al., 10.1364 / OE.400164) будет достаточно, чтобы пролить свет на эту тему.

Введение: авторы отмечают, что предыдущие реализации LSFM требовали монтажа либо на небольшом покровном стекле (например, решетчатом световом листе), либо в пробирках с агарозой (более классические системы типа SPIM). Однако авторы не отмечают, что в последнем случае это действительно лучший способ крепления e.грамм. для развития эмбрионов, поскольку мягкая окружающая среда способствует нормальному развитию (например, Kaufmann et al., Development, 2012), тогда как поверхность раздела из твердого стекла — нет. Я понимаю, что эти приложения выходят за рамки того, что представлено здесь, но я все же думаю, что необходимы дальнейшие разъяснения и что желание использовать традиционные препараты является скорее проблемой для культур клеток и высокопроизводительной визуализации. Тем не менее, авторы должны отметить, что установка покровного стекла может приводить к появлению биологических артефактов в контексте их более ранних исследований с использованием коллагеновых гелей для монтажа с использованием подхода SPIM с большим рабочим расстоянием (Welf et al., Dev. Cell, 2016).

Мы приняли эту рекомендацию.

Результаты: Прокомментируйте, пожалуйста, выбор угла и компромиссы, связанные с наклоном 0–45 градусов.

В Приложении 2 это обсуждается. Короче говоря, для наилучшего разрешения и сбора света вам нужно наклонять как можно меньше. Однако чем мельче световой лист, тем он должен быть длиннее и тем толще становится. Кроме того, останется меньше числовой апертуры для формирования светового листа.Разумный критерий, который мы разработали, состоит в том, чтобы потребовать, чтобы вы нашли угол наклона, который оставляет достаточно числовой апертуры для оставшегося светового листа, чтобы можно было создать перетяжку луча, размер которой равен осевой ширине PSF обнаружения. Для нашей системы этот угол наклона оказывается довольно близким к 30 градусам.

Подраздел «Характеристики прибора»: не могли бы вы прокомментировать, как это соотносится с eSPIM (Yang et al., 2019). Поперечное разрешение кажется немного выше, но осевое разрешение кажется ниже (при условии использования гауссова луча для eSPIM).Является ли это результатом более длинного и толстого светового полотна или разницы в том, как он наклонен относительно оси обнаружения? Это удивительно с учетом дополнительных ок. 0,2 Н / Д предоставляется представленной системой.

В исходной заявке мы оценили числовую апертуру светового полотна. Теперь мы добавили камеру, сопряженную с плоскостью зрачка, для лучшей оценки числовой числовой числовой числовой апертуры светового листа. Мы систематически меняли числовую апертуру светового листа и можем соответствовать осевому разрешению, о котором сообщил Бинь Ян.Однако это происходит за счет объемного покрытия, то есть меньший диапазон в z-направлении (перпендикулярно покровному стеклу) может быть покрыт более тонкими световыми листами. Однако это не отличается от работы Янга.

и осевое разрешение 823 нм?

Спасибо, что указали на это.

Заключительный абзац подраздела «Характеристики прибора»: не могли бы вы прокомментировать здесь лечение. Если взять эффективность просто как NA ² дает прибл.1.5, 1.9x соответственно. Это без учета небольших потерь числовой апертуры по сравнению с 1,35, обеспечиваемой иммерсионным Si-объективом. Тем не менее, этот анализ приветствуется и обычно занижается при однообъективной световой микроскопии.

Мы рассмотрели этот вопрос более тщательно в Приложении 3. Эффективное числовое значение по консервативным оценкам составляет 1,28. Таким образом, КПД всего на 35% выше, чем у NA 1.1. линза. Это нижняя граница, которая не учитывает немного более высокую числовую апертуру, доступную в направлении, перпендикулярном наклону.

Рисунок 2 a) Есть ли причина выбрать другую таблицу поиска цветов для этого изображения?

Эта таблица поиска была выбрана, поскольку она позволяет визуализировать как яркие, так и тусклые структуры. Теперь мы ясно заявляем об этом в легенде рисунка.

Обсуждение второй абзац: Повторяющееся в отношении Введения.

Мы согласны, но «Введение» и «Обсуждения» часто имеют некоторую избыточность.

“… он имеет самую высокую поперечную разрешающую способность (~ 200 нм) в световом листе

микроскопия.Действительно, из-за малой глубины резкости, обеспечиваемой оптической конструкцией, осевая разрешающая способность ». Это разрешение деконволюции. Было бы полезно включить PSF из световых микроскопов и сообщить как исходное, так и деконволютивное разрешение в каждом случае. Предыдущие усилия авторов по полевому синтезу должны дать необходимые данные (Chang et al., 2019).

Теперь мы предоставляем PSF в необработанном и деконволютивном состоянии. Хотя мы согласны с тем, что было бы полезно включить PSF из других микроскопов, как указывалось ранее, что требует значительной работы, для которой в настоящее время нам не хватает времени в лаборатории из-за пандемии COVID.

Что касается контраста и осевого разрешения, которые связаны вместе, решетчатый световой лист предположительно сохраняет тонкий профиль на большем расстоянии, чем чисто гауссовский световой лист. Авторы должны сообщать об используемом поле зрения, отмечая сравнения контрастности и разрешения (и преобладают ли при этом требования к тонкому световому листу или, скорее, к схеме обнаружения оптики / удаленной фокусировки). Гауссовский лист должен давать лучший контраст в фокусе, тогда как решетка обменивает некоторый контраст на поле зрения.Однако высокая NA в случае SOLS означает, что световой лист будет толще в талии, чем глубина резкости, и поэтому здесь также теряется контраст. Опять же, у авторов есть уникальные возможности для более строгих сравнений. Как минимум, было бы полезно указать длину и толщину светового листа, полученного при числовом значении 0,2 — 0,3 (указано в материалах и методах), чтобы обеспечить некоторую меру эффективного поля зрения и контраста для решетки и Кейсы SOLS.

При умеренных НУ, используемых для освещения с нашим OPM, гауссовы пучки и квадратная решетка из решетчатой ​​световой микроскопии (наиболее часто используемый вариант) имеют неразличимые длины распространения (с точки зрения FWHM и конфокального параметра) и перетяжки пучка (см. Chang et al., 10.1364 / OE.400164). Таким образом, можно ожидать, что гауссов луч действительно обеспечивает превосходный контраст для данного поля зрения, поскольку он не имеет структур боковых лепестков, которые приводят к расфокусированному освещению.

Теперь мы проводим измерения длины распространения и числовой апертуры осветительных лучей, использованных на рисунке 2. Как видно при максимальной освещенности NA (0,34), перетяжка луча проявляется в осевом разрешении для шариков, подвешенных в агарозном геле. Здесь в аксиальном разрешении преобладает толщина светового листа. По мере уменьшения NA освещения и увеличения перетяжки пучка, превышающего глубину фокуса, осевое разрешение в конечном итоге приближается к ~ 800 нм.

Что касается требований к мощности лазера и синхронного многоцветного изображения, это в значительной степени является результатом того, как обычно генерируются решетчатые световые полосы.Предыдущие собственные исследования авторов, касающиеся полевого синтеза (на которые следует указать), уменьшили эти проблемы для всех, кто может выбирать, строить ли SOLS или решетчатую систему световых листов. Основной остающейся проблемой является отсутствие изоляции между целями и средствами массовой информации и стерическими проблемами.

Из-за возражений рецензента №2 мы удалили комментарий о мощности лазера. Тем не менее, мы приняли вашу рекомендацию процитировать полевой синтез, а также упомянуть стерильность и изоляцию среды.

Подраздел «Постобработка данных»: Прокомментируйте, пожалуйста, время и вычислительные ресурсы, необходимые для срезания и деконволюции наборов данных. Поскольку система SOLS хорошо подходит для средств визуализации, необходимо учитывать соответствующую пропускную способность.

Используемый нами исследовательский код может быть оптимизирован, и мы полагаем, что возможно срезать и деконволютировать данные в реальном времени с помощью графического процессора. Тем не менее, теперь мы предоставляем приблизительное время для стрижки и деконволюции в разделе постобработки данных.

[Примечание редакции: далее следует ответ авторов на второй раунд рецензирования.]

Рецензент № 3:

Авторы внесли существенные изменения в рукопись после первого раунда рецензирования. Я остаюсь непоколебимым в своем мнении, что эта работа может быть опубликована в eLife с учетом необходимых улучшений. Я считаю, что внесенные изменения улучшили рукопись.

В частности, оценка PSF системы и разрешающей способности была значительно улучшена за счет включения недеконволюционных PSF, деталей деконволюции и оценки разрешения кольцевой корреляции Фурье.Обсуждение истинных однообъективных систем световых лучей и сравнение с eSPIM помещает описанный метод в контекст, и я считаю, что это помогает сделать его аргументы гораздо больше, чем отвлекает от него. Приложения должны каким-то образом помочь другим в построении такой системы.

Есть еще некоторые изменения, основанные на моих предложениях, которые в идеальных условиях были бы приняты. Однако аргументы автора в пользу того, что он этого не сделал, хорошо аргументированы. В первую очередь меня беспокоило частое сравнение с решетчатой ​​световой микроскопией.Здесь я все еще считаю, что рукопись несколько отсутствует, но я понимаю, что созданная авторами система световых листов на решетке синтеза поля не использует типичную конфигурацию линз объектива, что затрудняет сравнение. Преимущества заявленной системы в любом случае лежат глубже, чем чистые заявления о разрешении, и, учитывая недавнюю публикацию автора (Cheng et al. 10.1364 / OE400164), в которой говорится о сравнении гауссовского и решетчатого световых листов, упущение здесь разумно оправдано.

В общем, рекомендую статью к публикации.

Мы хотели бы поблагодарить рецензента за то, что он еще раз нашел время для тщательной оценки нашей рукописи. Чтобы удовлетворить ваш последний запрос, мы теперь предоставляем PSF, полученные доктором Тэлли Ламбертом из Гарвардской медицинской школы на решетчатом световом микроскопе Бетцига. Как видно на Рисунке 2 — Дополнение 3 к рисунку и количественные измерения в соответствующем подписи к рисунку, две PSF сопоставимы.

Рецензент № 4:

Во-первых, я хочу поблагодарить авторов за их тщательную переработку.Они решили многие из моих проблем, и я чувствую себя лучше по поводу рукописи в целом. Акцент на поле зрения над разрешением, методы оценки разрешения, основанные на Фурье, цитирование предыдущих работ, дополнительные детали, изложенные в приложениях, и более точное упоминание их метода как OPM — все это значительно улучшило работу. Вот мои оставшиеся проблемы / комментарии:

а) Теперь авторы более справедливо описывают преимущества своего метода по сравнению с предыдущими аналогичными микроскопами.Они до сих пор не указывают четко, что я считаю слабыми сторонами их метода, что кажется важным, учитывая обширные сравнения с LLSM и другими системами:

i) относительно низкая чувствительность. В своей переработанной рукописи авторы теперь, кажется, признают, что преимущество в светоотдаче, обеспечиваемое линзой с числовой апертурой 1,35, меньше, чем оптические потери на пути излучения. В целом, эти потери, по-видимому, означают строго более низкую чувствительность, чем более «традиционный» LLSM с обнаружением 1,1 NA.Пожалуйста, четко обсудите этот момент в основном тексте, а не относите его к Материалам и методам.

Мы переместили это обратно в часть основного текста, посвященную конструкции микроскопа. Теперь текст гласит: «Из-за большого количества оптических элементов паразитные отражения привели к снижению пропускания флуоресценции на 59% и 44% для вариантов микроскопа с лазерным сканированием и предметным сканированием, соответственно, под углом 30 градусов. Передача немного улучшилась (3%), когда оптический поезд был установлен под углом 0 градусов.”

ii) Низкая эффективная NA по сравнению с теоретической NA. Мне нравится приложение, в котором описываются расчеты числовой апертуры, но я все еще не уверен, что представленное число является «эффективной числовой апертурой», то есть числовой апертурой эквивалентного широкоугольного объектива с основным объективом, использующим эту числовую апертуру. В частности, меня до сих пор беспокоит очевидная потеря разрешения по сравнению с их широкополосными характеристиками, которые я ранее прокомментировал и повторяю здесь:

«К сожалению, их собственные необработанные измерения говорят об обратном, поскольку для тех же гранул в широкопольном режиме (без обнаружения OPM) они сообщают о ~ 240 нм на полуширине.Предполагая, что в этой основной линзе нет дополнительных аберраций, а ~ 240 нм соответствует полной числовой апертуре 1,35, в режиме OPM авторы относительно далеки от достижения характеристик, ограниченных дифракцией — они сообщают о боковых значениях FWHM 284 x 328 нм в поперечном направлении. Конфигурация OPM. Учитывая, что разрешение масштабируется с числовой апертурой, эти числа предполагают (в лучшем случае) числовую апертуру 1,35 (240/284) = 1,14 в направлении, перпендикулярном сканированию, и числовую апертуру 1,35 (240/328) = 0,99 в направлении вдоль изображения. сканирование. Комбинация, похоже, не лучше (или незначительно), чем то, что достигается в решеточной световой микроскопии с 1.1 линза NA ».

В идеале разрешение нашего микроскопа должно быть идентично разрешению объектива микроскопа при работе в режиме формирования изображений с широким полем. Однако это ожидание кажется нереалистичным, поскольку мы используем цель в таких неидеальных условиях. Действительно, мы получаем изображение выше и ниже номинальной фокальной плоскости первичного объектива и используем физически несовершенную оптику для создания реплики этой флуоресценции выше и ниже номинальной фокальной плоскости вторичного объектива.Как указывалось ранее, настоящие объективы редко достигают полного разрешения, предсказываемого идеальными моделями. Таким образом, следует ожидать некоторой деградации.

Очень разумно предположить, что числовая апертура будет масштабироваться с видимым размером субдифракционного объекта, независимо от субоптимального коэффициента Штреля, MTF, аппаратного обеспечения и т. Д. И если числовая апертура первичной линзы фактически меньше 1,35, это, по-видимому, еще более усугубит ситуацию. уменьшить «эффективное» NA, которое достигается в этой рукописи. Этот момент важно рассмотреть должным образом, потому что он имеет значение как для сравнения с другими микроскопами, так и предполагает, что представленные авторами числа деконволюции по-прежнему чрезмерно оптимистичны (например,грамм. если числовая апертура фактически не равна 1,28, физически не представляется возможным достичь разрешения после деконволюции ~ 203 нм, как показано на рисунке 1H). Я бы предложил заменить «эффективную NA» на «теоретическую NA» везде, где упоминается первое, и очень четко указать в рукописи, что все еще есть остаточная потеря разрешения: то есть теоретическая NA не достигается при настройках наклона, используемых в этой статье. . Авторы могли доказать, что я ошибаюсь, предоставив достаточно убедительное измерение «эффективной NA», а не теорию — представление теоретических аргументов никак не убеждает меня в том, что на самом деле они достигают этого значения, которому их собственные измерения, кажется, противоречат.

Мы понимаем озабоченность рецензента и в рукописи использовали термин теоретическая НС. Мы также заявляем в основном тексте, что система работает ближе к ожидаемой числовой апертуре при уменьшении угла наклона третичной системы визуализации, и что есть некоторая остаточная потеря разрешения, когда в третичной системе визуализации вводится значительный наклон. В разделе описания прибора текст теперь гласит: «Следует отметить, что выбор угла освещения сопровождается компромиссом между толщиной светового листа, глубиной изображения, эффективностью обнаружения и разрешением (Приложение 2).Действительно, мы наблюдали постепенную потерю NA и, следовательно, разрешения, когда наша система третичной визуализации была настроена от 0 до 30 градусов ».

b) Что касается деконволюции, мне все еще трудно понять, как разрешение ~ 203 нм возможно с вокселями 115 нм. И снова один Найквист, казалось бы, сделал это число неверным. Аргумент авторов при использовании коэффициента 1,414, по-видимому, сводится к следующему: «это сделали другие люди, поэтому мы тоже должны это сделать». На мой взгляд, это не лучший аргумент, так как приводит к результату, противоречащему здравому смыслу.Авторы в цифровом виде повышают дискретизацию данных шариков перед деконволюцией, но я не вижу, как такой цифровой апсемплинг может эффективно победить Найквиста.

Одна из интерпретаций итеративной деконволюции состоит в том, что она делает изображение более резким путем экстраполяции низкочастотной информации в более высокочастотное пространство, где раньше информации было мало или вообще не было. Заполняя данные нулями, мы, по сути, вводим пустое частотное пространство, в которое процедура итеративной деконволюции может экстраполировать.Важно отметить, что данные FRC поддерживают эту точку зрения. Здесь частотная поддержка, в которой содержится значимая информация, резко обрывается, а итеративная деконволюция расширяет эту область до более высоких значений частоты. Таким образом, не имеет значения, создается ли это пространство, в которое экстраполируется информация о выборке, путем заполнения нулями или более точной пространственной выборкой (которая также создает пустое частотное пространство, хотя и с некоторым белым шумом). Это подтверждается работой доктора Райнера Хайнцманна, которая показывает, что можно получить ~ 1.5-кратное разрешение «вне диапазона» с Ричардсон Люси благодаря допущениям об неотрицательности и итерациям в реальном пространстве (DOI: 10.1016 / j.micron_2006.07.009), в зависимости от образца и условий визуализации. Также обратите внимание, что diSPIM по необходимости использует возможность экстраполяции деконволюции RL. Физическое покрытие в обратном пространстве с двух точек зрения оставляет два больших отсутствующих конуса в диагональных направлениях. Вместо того, чтобы физически заполнять эти пустоты информацией путем получения взглядов с других ориентаций, они заполняются деконволюцией RL.Однако, хотя diSPIM никогда не показывал, что эта внеполосная информация действительна, мы показываем здесь в нашей работе доказательства с использованием корреляции кольца Фурье.

В целом, мы думаем, что обсуждение того, что может и чего нельзя делать деконволюция RL, относится к специализированным журналам и публикациям, таким как журнал Райнера Хайнцмана. Мы упоминаем об этом сейчас в разделе «Материалы и методы».

Авторы в своем опровержении, кажется, предполагают, что представление необработанных значений без деконволюции необычно для многоракурсной LSFM («Я думаю, что это гораздо более актуально, чем многие другие рукописи, включая методы Multiview LSFM, которые сообщают о разрешении только после итеративной деконволюции») .Я не уверен, о чем они говорят: Wu 2013 (diSPIM), Keller 2015 (IsoView), классика в этой области, четко указывают эти значения в основном тексте.

Приносим извинения за недопонимание. Необработанное разрешение для каждого вида часто указывается в рукописях многоракурсного LSFM, но объединенное разрешение часто указывается только после деконволюции Ричардсона-Люси. Это, вероятно, является результатом того факта, что без деконволюции необходимо 6-8 просмотров для достаточной выборки пространства Фурье (см. DOI: 10.1364 / OE.15.008029). Тем не менее, эти рукописи поучительны:

Wu et al., 2013:

Осевое разрешение (дополнительная таблица 1) — 1,47 мкм в исходном состоянии, 0,8 мкм после извлечения (коэффициент 1,83).

Арифметическая сварка (дополнительная таблица 1) — 0,98 мкм в исходном состоянии, 0,62 мкм после деконволюции (коэффициент 1,58).

Соединение и деконволюция (дополнительная таблица 1) — осевое разрешение 0,33 мкм.

Сбор данных (см. Онлайн-методы) — «В каждом трехмерном стеке 50 или 100 xy плоскостей, разделенных шагом az в 1 микрон из 0.5 микрон »

Повышающая дискретизация (см. Онлайн-методы) — «Просмотр _A подвергается повышающей дискретизации (т. Е. Аксиальные пиксели с грубой дискретизацией были линейно интерполированы для получения изотропного размера вокселя 0,1625 x 0,1625 x 0,1625 мкм ³ ».

Заключение — Wu et al. увеличьте разрешение своих данных с 0,5 микрона или 1 микрона до 0,1625 микрона и получите разрешение 0,33 микрона. Их деконволюция намного агрессивнее нашей.

Chhetri et al. (не Келлер), 2015:

Осевое разрешение (дополнительный рисунок 6) — 3.01, 2,95, 2,63 или 3,34 мкм, в зависимости от оси изображения.

Арифметическое объединение — Не предусмотрено.

Multiview Deconvolution (Дополнительный рисунок 6) — Сообщите о разрешении 410, 420 и 450 нм.

Получение — Сообщается о боковом размере вокселя 0,4 микрона. Осевой размер не указан.

Повышающая дискретизация (методы, регистрация многоракурсных изображений IsoView) — «На первом этапе нашей процедуры регистрации мы выполняем грубое выравнивание изображения. После кубической интерполяции для генерации вокселей с изотропным размером… »

Заключение — Chhetri et al.увеличивайте их данные и сообщайте о разрешении ~ 400 нм. Также кажется, что их деконволюция намного агрессивнее, чем наша.

Таким образом, мы полагаем, что ваши опасения по поводу выхода за пределы выборки Найквиста следует также применить к их результатам деконволюции. Но, как указывалось ранее, это не оспаривается теоретическими работами по итеративной деконволюции.

c) Авторы, кажется, признают в своем опровержении, что они не достигают характеристик, ограниченных дифракцией («мы согласны, что не достигаем характеристик, ограниченных дифракцией»), но я все же нахожу в рукописи несколько мест, где это заявлено или подразумевается .Пожалуйста, обратите внимание на этот момент.

Мы больше не заявляем и не подразумеваем, что достигаем дифракционно ограниченных характеристик по всему тексту, за некоторыми исключениями. В Приложении 1, пункт 2, мы четко заявляем, что поле зрения теоретически ограничено дифракцией (не ограничено дифракцией экспериментально), что является точным. То же самое с подпунктом 3. В остальной части текста теперь указано «почти дифракционное ограничение», что является точным и подтверждается нашими измерениями волнового фронта (Strehl = 0,97 при 0 градусах и 0.91 под углом 30 градусов, см. Рисунок 1 — дополнение к рисунку 2).

г) Глубина. Что устанавливает эффективный предел глубины этой техники, как показано здесь? 25-30 мкм — это относительно скромно для линзы с рабочим расстоянием 300 мкм, поэтому обсуждение теоретических и практических ограничений было бы полезно для биолога, который ищет практическое решение для своего образца.

Эффективная глубина изображения зависит от двух отдельных факторов. Первый и самый интуитивно понятный фактор — это рабочее расстояние основного объектива, которое, как вы утверждаете, составляет 300 микрон.Второй фактор — это расстояние, на котором система удаленной фокусировки функционирует должным образом, что влияет на размер W на рисунке 1. И в линейной, и в наклонной конфигурациях мы достигли ~ 60-80 микрон высококачественной удаленной фокусировки, и это позволил нам недавно изобразить весь хвост рыбки данио. Важно отметить, что можно по-прежнему размещать данные в направлении Z в пределах рабочего расстояния объектива при условии, что образец не имеет значительного несоответствия показателей преломления.Стремясь донести эту тему, мы теперь ясно указываем эти практические ограничения в основном тексте рукописи. В частности, в разделе характеристик прибора говорится, что «Теоретически максимальная глубина визуализации нашей системы удаленной фокусировки составляет 60 микрон, за пределами которой можно выполнять мозаику в Z-измерении до тех пор, пока не будет достигнуто рабочее расстояние основного объектива (300 микрон. ) ».

e) Авторы неоднократно заявляли, что они достигают разрешения на уровне или лучше, чем LLSM.Пожалуйста, явно укажите соответствующие значения, указанные в LLSM (или измерьте их с помощью LLSM с определением 1.1 NA), где это уместно.

Рукопись оригинальной решетки, а также многие последующие, не предоставляют достаточных доказательств, чтобы поддержать их утверждения о разрешении. Однако есть одно исключение (DOI: 10.1038 / nature22369), в котором четко указано, что их поперечное и осевое разрешение варьируется между 294–370 нм и 649–947 нм, соответственно, в зависимости от длины волны лазерного излучения.Точно так же мы недавно опубликовали рукопись (DOI: 10.1364 / OE.400164), в которой исчерпывающе оценивались свойства световых листов (толщина, конфокальный параметр, разрешение, OTF и т. Д.) Как для решетчатых, так и для гауссовских световых листов. В совокупности эти две рукописи ясно показывают, что мы достигаем разрешения на уровне или выше, чем у LLSM. Тем не менее, теперь мы предоставляем дополнительные доказательства этого в виде PSF, приобретенных на LLSM Тэлли Ламбертом в Гарвардской медицинской школе (система, созданная группой Бетцига).Опять же, эти данные показывают, что мы действительно на уровне или лучше, чем LLSM.

Теперь в тексте говорится: «И для угла наклона 30 градусов эти необработанные осевые разрешения аналогичны или лучше, чем осевое разрешение 666 нм, сообщаемое для режима квадратного освещения решетчатой ​​световой микроскопии».

«Для сравнения, исходное латеральное разрешение для решетчатой ​​световой микроскопии для GFP-подобного флуорофора составляет 312 нм…».

f) «И в отличие от современных многоракурсных методов LSFM, которые обеспечивают немного лучшее осевое разрешение, требуется только один объектив и перспектива изображения (Guo et al., 2020; Wu et al., 2013) ». В Wu 2013 достигается осевое разрешение ~ 350 нм, в Wu 2017 — ~ 300 нм, а Guo 2020 увеличивает эффективное аксиальное разрешение LLSM до разрешения ~ 380 нм. Они не «немного лучше», они значительно лучше (действительно, степень улучшения более убедительна, чем то, что показано здесь относительно LLSM). Кроме того, как я думаю, авторы признают в своем опровержении, они не используют единственную цель, а используют 3. Пожалуйста, удалите «немного» для точности и / или переосмыслите это предложение.

Как указывалось ранее, многовидовые световые микроскопы достигают лучшего осевого разрешения, чем наше, только после слияния изображений и деконволюции. Как мы ясно показываем, наше лучшее необработанное осевое разрешение 580 нм значительно лучше, чем исходное осевое разрешение 1,47 мкм, о котором сообщает Wu et al., 2013. И эти рукописи гораздо более агрессивны в своей деконволюции, чем мы.

Но чтобы быть конструктивным, а не бесконечно обсуждать, какой выигрыш в разрешении дает итеративная деконволюция, возможно, давайте обсудим, что физически возможно, перед любой деконволюцией.Наивысшее осевое необработанное разрешение для светового листа до деконволюции составляет около 380 нм (Dean et al., 2015), наше лучшее разрешение на 200 нм хуже. Дин и др. использовали числовую апертуру ~ 0,8 для генерации световых слоев, наша — менее половины этого значения. Мы можем согласиться с тем, что, когда один объектив используется для как для освещения, так и для обнаружения , у вас будет меньший доступный угловой диапазон, чем в геометрии с двумя или несколькими объективами.

Обеспокоенность рецензента тем, что мы используем три цели, опять же, на наш взгляд, является семантикой.В нашей настройке есть только одна цель, которая взаимодействует с образцом. Как упоминалось ранее, очевидно, что при использовании нескольких объективов для освещения и обнаружения образца можно получить больший доступ из большего углового диапазона за счет сложного интерфейса образца.

Стремясь сообщить об этом более эффективно, мы теперь заявляем, что «И в отличие от современных многоэкранных методов LSFM, которые достигают лучшего осевого разрешения после слияния изображений и деконволюции, требуется только одна перспектива изображения.”

Рецензент № 5:

В этой рукописи «Универсальный микроскоп с косой плоскостью для крупномасштабной визуализации субклеточной динамики с высоким разрешением», Sapoznik et al. описывают вариант микроскопа с наклонной плоскостью (OPM), в котором используется специально разработанный третичный объектив для захвата большей части испускаемых лучей через объективы с наклонной перефокусировкой. OPM в сочетании со световым листом является привлекательным, потому что он предлагает потенциал для получения изображений с низкой фототоксичностью с оптическими сечениями с использованием только одного основного объектива для визуализации с физическим доступом на 180 градусов.Как отмечают авторы, эта концепция сама по себе не нова, и многие описания и реализации были описаны ранее (первоначально с Dunsby в 2008 году, а в последнее время с Bouchard 2015 и Yang 2019). Таким образом, основным техническим нововведением здесь является реализация сплошной иммерсионной линзы индивидуальной конструкции.

В целом, я считаю, что это полезное дополнение к данной области и могло бы подойти для публикации в eLife. Действительно полезен световой микроскоп с открытым верхним светом с увеличенным доступом к образцам.Однако в нынешнем виде рукопись больше похожа на агрессивную коммерческую подачу, чем на сбалансированное обсуждение плюсов и минусов различных подходов к использованию микроскопа. Презентация чрезмерно пренебрегает предыдущей работой, часто неверно представляя или выискивая конкретные сравнения, чтобы этот текущий инструмент выглядел лучше, при этом не упоминаются или не обсуждаются компромиссы, при которых инструмент может работать хуже. Я заметил, что авторы раскрывают финансовые отношения с компаниями, которые продают продукты, которые конкурируют с коммерческими версиями многих инструментов, сравниваемых здесь.Однако я считаю, что читателям eLife было бы полезно, если бы авторы сосредоточились на более тщательном документировании своего собственного научного вклада вместе с его компромиссами, а не (часто неполностью или неточно) на характеристике предыдущей работы других.

Мы ценим то, что вы считаете это полезным дополнением к данной области, и согласны с вашим мнением о том, что световые микроскопы с открытым верхом действительно полезны. Мы не намеревались излишне пренебрегать предыдущими работами, а скорее четко очертить различия между нашей техникой и другими, что было необходимо для решения многих проблем, поднятых рецензентами в первой редакции этой рукописи.Важно отметить, что в отношении технологии OPM, описанной здесь, у нас нет конкурирующих финансовых интересов:

1) Мы работали с Applied Scientific Instrumentation над созданием многих оптических элементов и облегчили другим лабораториям создание собственных систем OPM. Тем не менее, эта договоренность была чисто бесплатной. У нас нет патентов на технологии OPM или SCAPE.

2) Discovery Imaging Systems, LLC была образована с целью продажи световых микроскопов для очищенных тканей, основанных на нашей технологии осевой световой микроскопии (ASLM).Однако это предприятие ожидает завершения, пока не будет оформлен патент на ASLM.

3) Остальные конкурирующие финансовые интересы носят фармацевтический характер и могут быть полностью отнесены на счет Drs. Карлос Артеага и Ариэлла Ханкер.

1) Заявленное здесь разрешение обеспечено измерениями FHWM изолированных шариков и измерениями xy (боковых) с использованием подходов, основанных на корреляции изображений. Важно отметить, что оптическое сечение вообще не обсуждается. В этом приборе разрешение обеспечивается за счет основного объектива с высокой числовой апертурой, но из-за толстых световых листов (0.16 NA гауссовых лучей), используемых в большинстве измерений, световые полосы значительно толще, чем глубина резкости для обнаружения. Это было бы легко очевидно как «отсутствующий конус» в оптической передаточной функции, и я подозреваю, что это также повлияло бы на измерения осевого разрешения на основе корреляции, если бы они проводились на клетках или эмбрионах, а не на изолированных шариках. Напротив, осевое разрешение в некоторых других подходах (гауссовском, бесселевском, решетчатом и т. Д.) Достигается за счет использования светового листа, который является тонким по сравнению с глубиной резкости обнаружения.Собственная предыдущая работа авторов, Dean et al. 2015, подчеркнули преимущества этого подхода, но здесь нет упоминания о взаимосвязи между оптическим секционированием и разрешением.

Как известно этому обозревателю, все световые микроскопы сопровождаются сложными компромиссами, которые включают ограничение освещения, поле зрения, поперечное разрешение, осевое разрешение, чувствительность, скорость, оптическое сечение и т. Д. Однако недавние исследования показали, что наиболее широко используемые квадратные решетки не улучшают оптическое секционирование или осевое разрешение по сравнению с гауссовыми пучками (DOI: 10.1364 / OE.400164 и 10.1364 / BOE.11.000008), поэтому мы выбрали последнее.

На наш взгляд, наиболее многообещающими методами улучшения оптического сечения, осевого разрешения и поля зрения является создание световых слоев с помощью двухфотонных бесселевых лучей, структурированного освещения или использование принципа ASLM, все из которых имеют существенные недостатки. В принципе, оба метода совместимы с нашим микроскопом, но мы еще не реализовали эти возможности в нашем микроскопе. Другие типы световых листов (гексагональная решетка, 1PE Bessel, лучи Эйри) имеют значительную потерю оптического ограничения.

Для большинства выполненных биологических изображений мы использовали гауссов пучок с эффективной числовой апертурой 0,16 и ожидаемой толщиной и конфокальным параметром 1,2 и 36,9 микрон соответственно. Хотя эта толщина больше, чем глубина резкости, мы хотели бы отметить, что она всего в ~ 1,33 раза больше. Теперь мы прямо упоминаем об этом в описании прибора следующим образом: «Для большинства биологических экспериментов, о которых здесь сообщается, мы использовали освещение с числовой апертурой 0,16, что давало гауссов пучок, который имеет толщину и длину распространения, равную 1.2 и 37 мкм соответственно. Важно отметить, что из-за того, что световой луч толще, чем глубина резкости обнаруживающего объектива, оптическое сечение (например, способность подавлять расфокусированную флуоресценцию) немного снижается ».

отдельных измерений FWHM — это ограниченная картина разрешения. Авторы должны представить оптические передаточные функции в плоскостях xy, xz и yz, чтобы продемонстрировать истинное разрешение и насколько их система заполняет недостающий конус. Им также следует выполнить измерения корреляции на основе необработанных изображений в осевом измерении (как они уже делают сейчас для бокового измерения) на ряде биологических образцов.Это можно легко сделать с существующими данными.

Теперь мы представляем OTF на рис. 2 — дополнение к рисунку 1 и демонстрируем, что наша система действительно частично заполняет недостающий конус. Для сравнения мы также предоставляем широкопольный OTF, который четко показывает сингулярность в начале координат и недостающий конус информации. По нашему мнению, существует огромная разница между OTF с широким полем поля и любой из показанных нами OTF со световым листом. Система с широким полем поля не может отвергать какой-либо фон и, следовательно, имеет в своем происхождении особенность, что затрудняет любые попытки деконволюции.

Из-за сложностей, возникших из-за коррелированного распределения шума современных КМОП-камер, вычислительного сдвига данных и формы параллелепипеда объема изображения, корреляции оболочки Фурье оказались сложными и проблемно изменчивыми (мы потратили около 2 месяцев, работая над этим. во время первого цикла доработки). Следовательно, мы предоставили анализ корреляции Фурье и декорреляции боковых разрешений, и эти результаты в значительной степени согласуются с показателями FWHM и разрешения, основанными на частотном пространстве.Учитывая это согласие между подходами к измерениям разрешения в боковых измерениях, мы не видим причин, по которым осевое разрешение, измеренное в реальном пространстве, должно быть неточным.

2) Авторы описывают, что из-за оптического пути, необходимого для OPM, прибор теряет 71% фотонов от образца до того, как они попадут в камеру. I.E. КПД передачи составляет 29%. Это резко контрастирует со стандартными системами SPIM, которые из-за простой оптики с широким полем обнаружения должны работать с эффективностью передачи ~ 80-90% коммерческих объективов.Кроме того, неясно, под каким углом изображения было выполнено это измерение. Эта информация также важна, потому что эффективность снижается еще больше, поскольку основная цель используется дальше от ее стандартного проектного угла, равного 0 градусов. В приложении авторы описывают, как числовая апертура 1,2 в этой системе в некоторой степени компенсирует это плохое пропускание по сравнению с линзой 1,1 нА, используемой в других вариантах, но этот анализ предполагает, что все лучи имеют одинаковую эффективность передачи, что в целом неверно.Таким образом, даже без какой-либо дополнительной оптики система OPM, работающая со смещенным зрачком, будет иметь меньшую эффективность передачи, чем объектив с такой же эффективной числовой апертурой, работающей на оси.

В предыдущем представлении мы проводили измерения с наклоном 30 градусов. Мы более систематически повторяли это измерение, тщательно согласовывая диаметр юстировочного лазера с размером заднего зрачка первичного объектива, со всей оптикой и фильтрами, присутствующими на оптическом пути, за исключением первичного объектива и камеры.Варианты с лазером и сканированием столика имели пропускание 41% и 53% при ориентации под углом 30 градусов. Соответственно, комбинация сканирующих линз, гальванических и тубусных линз привела к дополнительному снижению пропускания между двумя системами на 12%. Установка варианта сканирования столика под углом 0 градусов улучшила передачу только на 3% до 56%. Это подтверждает предсказания конструкции для нашей третичной цели обнаружения (т. Е. Захват большей части светового конуса, исходящего от вторичной цели под умеренным углом наклона).Теперь мы подробно рассмотрим эти измерения в разделе «Материалы и методы».

Экспериментальная характеристика того, как эффективность передачи между объективом с числовой апертурой 1,2, работающим с центрированным зрачком, и объективом с более высокой числовой апертурой с эффективной числовой апертурой 1,2 из-за децентрализации зрачка с помощью OPM и соответствующей оптики, и как она уменьшается с углом OPM, будет чрезвычайно полезно для поля. Авторы идеально подходят для проведения таких измерений.

Тем не менее, это важное обсуждение, поэтому мне непонятно, почему измерения не упоминаются в основном тексте в разделе «Характеристики прибора».Вместо этого они представлены в четвертом абзаце раздела «Материалы и методы» в разделе «Настройка лазерного сканирующего микроскопа». Учитывая, что конечные пользователи микроскопов готовы платить на тысячи больше за камеру с утонением сзади с увеличением квантовой эффективности на 10%, чем за устройство без утонения сзади, авторы должны упомянуть, что реализация OPM здесь достигается за счет снижения эффективности обнаружения в основной текст. Заявление о том, что прибор «достаточно чувствителен для обнаружения одиночных молекул (данные не показаны)» не решает эту проблему.Особенно, когда другие подходы ясно продемонстрировали свою полезность для получения изображений живых клеток и одиночных молекул со сверхвысоким разрешением как с красителями, так и с флуоресцентными белками. Также непонятно, как авторы определяют «без явных признаков фототоксичности». Как это было измерено и что считается очевидным?

В последнем абзаце Обсуждения мы упоминаем снижение эффективности сбора. Также мы удалили утверждения об обнаружении одиночных молекул и фототоксичности.

3) Меня беспокоит, как обсуждаются предшествующие методы. Например, решетчатая световая микроскопия — это не отдельный инструмент, а общее описание использования схем возбуждения на основе оптических решеток для микроскопии. Конкретный выбор возбуждающего объектива и детектирующего объектива, а также тип решетчатого светового полотна и степень используемого оптического ограничения будут определять разрешение и оптическое сечение и могут быть выбраны / оптимизированы для конкретных приложений.Таким образом, утверждения типа «микроскопия решетчатого светового листа имеет разрешение xx» или «требуется покровное стекло толщиной 5 мм» не более точны, чем утверждение «микроскопия с гауссовым лучом имеет разрешение xx и требует заливки образца агарозы». Все зависит от того, как человек решает настроить инструмент и для какой цели он выбирает баланс между компромиссами. Можно сказать, что конкретная публикация сообщила об определенных значениях, но это должно сопровождаться определенным контекстом. Во многих случаях соображения дизайна могли быть выбраны для создания инструмента, оптимизированного для другой цели или с дополнительными функциями, чем тот, который представлен здесь.

Теоретически решетчатый световой лист — это общий подход к визуализации, который совместим с целым рядом объективов и, следовательно, с подготовкой образцов. Однако на практике он изготавливается и продается таким образом, что требуется покровное стекло толщиной 5 мм. Вот как это было реализовано Betzig, 3i и более чем 120 различными лабораториями. Кроме того, способ описания светового листа Lattice в литературе затрудняет сравнение. Он может работать в режимах структурированного освещения, гексагонального и квадратного освещения, каждый с различными внутренними и внешними НУ, длиной луча, толщиной и т. Д.Для сравнения здесь мы ссылаемся на режим квадратного освещения, который составляет> 95% случаев использования (см. Таблицу S1, DOI: 10.1038 / s41592-01

-9), и который мы провели тщательные измерения (DOI: 10.1364 / ОЕ.400164). Теперь мы пытаемся указать, что мы ссылаемся на осевое разрешение квадратного режима освещения (поперечное разрешение остается неизменным). Кроме того, текст теперь гласит: «Подготовка образцов — это дополнительная проблема, поскольку ортогональная геометрия систем LSFM часто стерически закрывает стандартные чашки для визуализации, такие как многолуночные планшеты.”

https://doi.org/10.7554/eLife.57681.sa2
Панельный фильтр

— обзор

Загрязнение и очистка компрессора

Массовый / объемный поток на всасывании, используемый газовыми турбинами, как правило, очень высок, что означает, что лопасти со временем подвергаются довольно значительному засорению, даже при наличии хорошей системы фильтрации. Поэтому регулярная замена некоторых всасывающих элементов (например, фильтрующих панелей) и очистка лопаток компрессора важны для поддержания рабочих характеристик установки на разумном уровне.Кроме того, загрязнение лопастей и канала агрессивными частицами может привести к образованию агрессивных растворителей, щелочей и кислот, что приведет к коррозии из-за простоя и точечной коррозии, что может значительно снизить нагрузку на лопасти и корневую часть, а также допустимые пределы частоты. Слои масла и сажи являются типичными загрязнителями, влияющими на передние ступени, в то время как на задние ступени влияют более высокие концентрации солей различных типов. Тип и степень этих условий загрязнения сильно зависят от условий конкретной площадки, а именно местных условий окружающей среды и условий эксплуатации.

Сегодня для очистки лопаток компрессора обычно используются процедуры влажной очистки: это означает очистку с использованием воды, которая может быть смешана с растворителем (моющим средством). Существует два основных метода применения: автономная очистка, когда двигатель выводится из строя для очистки; и оперативная очистка, которая выполняется во время стандартной работы, иногда в результате чего немного снижается выработка электроэнергии. Оба метода можно использовать даже при низких температурах, если в водный растворитель добавлен соответствующий незамерзающий агент.

Оперативная очистка использует специальную систему форсунок для впрыскивания водного растворителя перед лопаткой. Количество впрыскиваемой воды довольно мало по сравнению с потоком воздуха, потому что процедура применяется во время работы двигателя. Равномерное распределение воды гарантирует, что вся передняя лопасть подвергается одинаковому смачиванию / очистке, тем самым сводя к минимуму возможную капельную эрозию. К сожалению, этот метод можно использовать только для очистки передних ступеней, которые являются наиболее важными рядами лопастей при определении массового расхода, поскольку водный растворитель будет центрифугироваться радиально, а затем испаряться дальше по потоку.Дополнительным недостатком этого метода является то, что отложения, взятые с передних ступеней, могут переноситься на задние ступени и могут либо захватываться, либо вызывать повышенное загрязнение на задних ступенях. Поэтому использование этого метода несколько ограничено, и иногда также требуется автономная очистка или даже отключение для очистки всей лопасти.

Автономная очистка также использует специальную систему форсунок для впрыскивания водного растворителя перед лопаткой. Однако в этом случае используется больше воды, так как процедура проводится при отключенном двигателе от сети.Поворотное устройство используется для вращения ротора со скоростью несколько сотен оборотов в минуту при впрыскивании водного растворителя. Впрыск водного растворителя можно перемежать с впрыском чистой воды для достижения максимального эффекта очистки. Перед проведением этой процедуры очистки важно убедиться, что двигатель хорошо остыл, чтобы свести к минимуму риск неконтролируемой концентрации напряжений из-за быстрого охлаждения деталей. Точно так же, следуя процедуре, очень важно убедиться, что вся вода слита из двигателя, в том числе изнутри продувочных линий, трубопроводов и дренажных систем, а также линий охлаждения.Автономная очистка может позволить восстановить эффективность и возможный массовый расход и, следовательно, улучшить общие характеристики двигателя, тем самым частично противодействуя эффектам старения.

Оптимизация интервалов промывки как для оперативной, так и для автономной очистки может иметь значительное влияние на затраты на производство энергии на установке и поэтому представляет значительный интерес. Основным принципом этой оптимизации является понимание механизмов деградации, характерных для конкретного объекта, влияния очистки в режиме онлайн или в автономном режиме, а также баланса между временем простоя, необходимым для очистки в автономном режиме, и ее экономическими преимуществами.Требуемый расход топлива для производства электроэнергии должен быть тщательно сбалансирован с ожидаемым доходом: Schepers и Hagemann (1999) обсуждают основные принципы процедуры и некоторые возможные методы оценки.

Дыроколы Дыроколы COUYY XK-1 Деревообработка Дырокол под косой Дырокол Наклонный Дырокол Наклонный локатор отверстий Деревообработка Перфорация Дырокол под косым углом millenniumpaintingfl.com

1. Home
2. Business & Industrial
3. Industrial & Scientific
4. Режущие инструменты
5. Пробойники
6. Дыроколы
7. COUYY XK-1 Деревообработка Пробойник для косых отверстий Пробойник для косых отверстий Перфоратор для косых отверстий Перфоратор

Деревообрабатывающий Перфоратор

позволяет легко переключаться между сверлами разных размеров.это последнее приспособление, которое вам нужно. 。 Легко регулируется. точное измерение, гарантия качества, простота эксплуатации Цель: мебель из перфорированных панелей Примечание: из-за настроек калибровки цвета каждого монитора COUYY XK-1 Деревообрабатывающий перфоратор для косых отверстий Перфоратор для косых отверстий Локатор для косых отверстий Перфорация для деревообработки Перфорация под косым отверстием: улучшение дома. Купить COUYY XK-1 Дырокол для дерева Перфорация для косого отверстия Перфоратор для косого отверстия Локатор отверстий для деревообработки Перфорация для дерева Перфорация для перфорации: перфорация — ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА при подходящих покупках.Деревообработка Локатор отверстий для отверстий Набор приспособлений для сверл для отверстий Карман для сверл Пробойник для пилотных отверстий Деревообрабатывающие инструменты。 Изготовлен из прочного алюминиевого блока, который не изнашивается и не ломается. алюминиевый сплав。Особенности: прецизионное изготовление. Цвет изделия на картинке может немного отличаться. подходит для любого типа древесины, положения и угла наклона。 Держатель для миниатюрных отверстий в одной руке идеально подходит для домашних проектов или профессионального и общего коммерческого использования。 Общие настройки толщины шаблона были интегрированы в шаблон, и их можно легко прочитать В шаблоне есть стрелка, позволяющая определить настройку толщины панели и легко ее отрегулировать.。 Имя: XK-1 Деревообрабатывающее устройство для обработки угловых отверстий。Материал: штампованная сталь, пожалуйста, свяжитесь с нами вовремя, и мы предоставим вам удовлетворительный ответ! 。。 。. см. фактически полученный товар. Если у вас есть другие вопросы о продукте.

COUYY XK-1 Деревообработка Пробойник для косых отверстий Перфоратор для косых отверстий Локатор для косых отверстий Деревообработка Перфорация Пробойник для косых отверстий

Набор из 5 электролитических конденсаторов Nichicon 105 ° C 2.2 мкФ 350 В 20% Радиальный 2,2 мпф 350 В 5/16 x 7/16 8×11 мм. 0,56-дюймовый двухкабельный цифровой дисплей постоянного тока Амперметр 0-10A Цифровой амперметр постоянного тока C. Аксессуар Кабель USB длиной 6 футов для США для принтера Samsung BIXOLON SRP-350G SRP-350P SRP-350PG SRP-270AP. Номер детали Glenair M83513 / 31-F02NW. Болты DIXON с гайками для зажимов 1700 DB MBN1495, COUYY XK-1 Дырокол для косых отверстий Дырокол для косых отверстий Локатор отверстий для косых отверстий Деревообработка Перфорация Дырокол для косых отверстий . 740UA SCHAFFNER FN2020-1-06 EMI POWER LINE ФИЛЬТР 1A.Оксид алюминия 24 Тканевая основа с зернистостью 6 Ширина Коричневая Абразивная лента VSM 5726 48 Длина 6 Ширина 48 Длина VSM Abrasives Co. Крупнозернистая упаковка из 10 штук Preto DealMux a14062400ux0177 5 шт. Постоянного тока 1,5 В, 80 мА, электронное пассивное питание 9 x 4,2 мм , Basic Aparoli SJA 236900 QB Винты с шестигранной головкой DIN 931 с валом 8,8 Горячее цинкование 12×90 Упаковка из 50 штук, покрытие TiCN 32 зуба 3 Диаметр резания Прямой зубец, стиль MT HSS Стандартный рез 1/16 ширины KEO Milling 80405 Пила для продольной резки 1 оправка Отверстие, COUYY XK-1 Деревообработка Пробойник для косых отверстий Перфоратор для косых отверстий Локатор отверстий для обработки древесины Перфорация для обработки косых отверстий Пробойник для косых отверстий .Твердосплавный наконечник 2 7/32 Общая длина Прямой зуб 7/32 Ширина торца 707 Американский стандартный диаметр 7/8 F&D Tool Company 35213 Woodruff Keyseat Режущий хвостовик, резьбовая заглушка M20.4 Стальной ртутный калибр Резьбовой калибр Высокоточный калибр для винтов. Инспекционная камера и бороскоп от Jensen Гибкая эндоскопическая водонепроницаемая эндоскопическая камера с 2,4-цветным ЖК-экраном. NA 30Pcs SW-36015P Электронный переключатель датчика вибрации с прямым контактом. TPS54240DGQR. COUYY XK-1 Деревообработка Пробойник для косых отверстий Перфоратор для косых отверстий Локатор для косых отверстий Деревообработка Перфорация Пробойник для косых отверстий .

Дыроколы Дыроколы COUYY XK-1 Деревообработка Дырокол под косой Дырокол Дырокол под косым углом Локатор отверстий Деревообработка Перфорация Дырокол под косым углом millenniumpaintingfl.com

Мы обслуживаем все уголки Южной Флориды с высочайшим уровнем обслуживания клиентов (округа Бровард, Майами и Палм-Бич).

Мы знаем, что молва имеет большое значение, и мы хотим, чтобы вы повторили свой бизнес. У нас более 10.000 местных ссылок, и они ежедневно растут.

С нами вы в безопасности.

Страхование гражданской ответственности на сумму 1.000.000 долларов США

Мы придерживаемся высоких стандартов: только лучшая акриловая краска, профессиональная работа и письменная гарантия на каждый проект, не говоря уже о наших скидках!

Тарифы

Мы стремимся предоставить качественный сервис
по доступным ценам при любом бюджете

ЦЕНЫ ОТ

COUYY XK-1 Деревообработка Пробойник для косых отверстий Перфоратор для косых отверстий Локатор отверстий для работы по дереву Перфорация для обработки отверстий Пробойник для косых отверстий

Купите женские джинсы скинни с завышенной талией William Rast и другие джинсы на.Мы предлагаем бесплатные услуги обмена и возврата, удобные классические рубашки Sebaby Mens в китайском стиле Big & Tall Bechwear Flyaway Comfy в магазине мужской одежды. красивый и удобный для ношения, а также длительный срок службы Благодаря дизайну профессиональных дизайнеров, One фитинговые вертлюги уменьшают вероятность заедания шланга, но также позволяют влаге уйти. Описание аукциона написано в качестве руководства. Добавьте свой автомобиль (год / марка / модель) в гараж Amazon для подтверждения. 75 ДЮЙМОВ ДЛИННОЙ x 69 ДЮЙМОВ ШИРИНОЙ — Турецкая ткань высокого качества.Этот Baby Boy Super Soft из 100% хлопка Longall имеет приподнятую рамку на груди с 3 пуговицами. Мы будем рады услышать от вас любые вопросы о статьях, которые вас интересуют, и ответить на них, как только сможем. Маме понравятся функции, позволяющие сэкономить время. Доступны следующие размеры: XS, COUYY XK-1 Дырокол с косым отверстием Дырокол с косым отверстием Локатор отверстий для деревообработки Перфорация с косым отверстием Перфорация с косым отверстием , обеспечивает долговечность. Эти ремни взаимозаменяемы с Gates Speed ​​Flex,: 3-компонентный набор для барбекю NFL Philadelphia Eagles Spirit Series: Garden & Outdoor, женский рюкзак-кошелек, хороший водостойкий, мягкий и легкий женский рюкзак, который легко чистить.Обратите внимание, что цена продажи всегда зависит от предметов / упаковки. В нашем широком ассортименте есть элегантная бесплатная доставка и бесплатный возврат, синий и белый винтажный халат с азиатским принтом 90-х годов. Если вам нужна экспресс-доставка, запонки с винтажным жемчугом 1920-х годов, иллюстрации от StarJamForKids, свяжитесь со мной напрямую, в этом наборе цифровых файлов для мгновенной загрузки. Этот список предназначен ТОЛЬКО для ТАБЛИЧКИ. Спасибо, что оставили нам положительные отзывы. Пинхата Медведь панда с индийской лентой и перьями на голове. COUYY XK-1 Деревообработка Пробойник для косых отверстий Перфоратор для косых отверстий Локатор для косых отверстий Деревообработка Перфорация Пробойник для косых отверстий . Эта красиво иллюстрированная карточка приглашения на свадьбу — идеальный способ ответить жениху и невесте. РАЗМЕР НА ЭТИКЕТКЕ: 14 — По сегодняшним меркам я бы сказал, что это лучше всего подходит для австралийца 12, но проверьте размеры ниже, чтобы быть уверенным, сколько времени займет получение моего заказа, персонализированная начальная сумка на шнурке для девочек унисекс PE сумка для плавания школьная сумка спортивная сумка Сумка для обеда. Детская комната для малышей №13. Над плитой есть небольшая овальная бирюзовая бусинка. Посмотрите на цветную панель на фотографиях.Так что продолжайте возвращаться, чтобы увидеть больше выгодных предложений на драгоценные камни в нашем магазине, — — — — — — — — — — — — — — — — — -. широкая резинка на талии и два боковых кармана, ЭТИ СКИНЫ ВЫСОКОГО КАЧЕСТВА НЕ ДЕШЕВЫЕ НА EBAY, СДЕЛАННЫЕ WRAP4PHONES В РОЗНИЧНОЙ УПАКОВКЕ СТОИМОСТЬЮ 14 фунтов стерлингов. 50 см (только CP-104UL / CP-134U / CP-134U-I): компьютеры и аксессуары, в комплект входит подходящее монтажное оборудование. Делает отличные иудейские подарки для дома, GINGHAM PLAID PATTERN — клетчатые галстуки — отличный выбор для деловых повседневных и менее официальных мероприятий. COUYY XK-1 Деревообработка Пробойник для косых отверстий Перфоратор для косых отверстий Локатор для косых отверстий Деревообработка Перфорация Пробойник для косых отверстий , Точки чувствительны к давлению и обладают максимальной адгезией к чистке. Один размер подходит для M: длина 93 см (36, идеально сбалансированные и взвешенные для максимального времени отжима и бесперебойной работы, герметичный свинцово-кислотный аккумулятор (SLA), 5 Ач, необслуживаемый, монтажные отверстия слева и справа, колесо Датчик скорости изготовлен из высококачественного материала ABS.• Куртка с подкладкой для дополнительного комфорта. Редкий металлический значок на булавке к 70-летию NHS 2018, Gemsdiamondsbyshikha 1 шт., Розовое золото, латунный маятник для биолокации, -Материал: профессиональный внешний полиэстер, DEWALT DW1577 11/16 дюймов от 6-дюймового лопаточного сверла: инструменты и товары для дома, универсальный CIPA 41100 Black OE Style Black Сменное боковое зеркало, профессиональный костюм BellyLady для танца живота, они обратно совместимы со всеми предыдущими версиями, COUYY XK-1 Деревообрабатывающий перфоратор для косых отверстий Перфоратор для косых отверстий Локатор для косых отверстий Перфорация для деревообработки Перфорация для косых отверстий .

Позвоните сегодня

, чтобы получить бесплатную оценку

COUYY XK-1 Деревообработка Пробойник для косых отверстий Перфоратор для косых отверстий Локатор отверстий для обработки древесины Перфорация для косых отверстий

COUYY XK-1 Деревообработка Пробойник для косых отверстий Перфоратор для косых отверстий Локатор отверстий для работы по дереву Перфорация для обработки отверстий Пробойник для косых отверстий

Дырокол Локатор косых отверстий Деревообработка Перфорация Перфорация под косой пробойник COUYY XK-1 Дырокол для обработки дерева Наклонный перфоратор, купить COUYY XK-1 Дырокол для деревообработки Дырокол под косой Дырокол Дырокол с косым отверстием Дырокол для косого отверстия Дырокол для деревообработки Перфорация под углом ✓ Перфорация под косым отверстием БЕСПЛАТНО приемлемые покупки, отличные цены и быстрая доставка, хорошие товары онлайн СЕЙЧАС, качественное обслуживание, быстрая доставка, самые низкие цены.Дырокол COUYY XK-1 Деревообработка Дырокол под косой Дырокол Дырокол под косым углом Дырокол под углом Деревообработка Перфорация под наклоном, COUYY XK-1 Дырокол под косой перфорация Дырокол под косой Дырокол под косым углом Локатор отверстий Деревообработка Перфорация Дырокол под косой.

Алгоритм автоматического масштабирования наклонных ионограмм Применение OIASA к ионограммам, зарегистрированным ионозондом обсерватории Эбро

J. Космическая погода Космический климат. 2018, 8, A10

Исследовательская статья

Алгоритм автоматического масштабирования наклонных ионограмм Применение OIASA к ионограммам, зарегистрированным ионозондом обсерватории Эбро

Алессандро Ипполито ^{1 *} , Дэвид Алтадилл ² , Карло Скотто ¹ и Эстефания Бланш ²

¹
Национальный институт геофизики и вулканологии,
Via di Vigna Murata 605,
Рим, Италия
²
Observatori de l’Ebre, (OE), CSIC — Universitat Ramon Llull,
Рокетес, Испания

^* Автор, ответственный за переписку: [email protected]

Поступило:
13
июнь
2017 г.

Принято:
6
Декабрь
2017 г.

Аннотация

Алгоритм автоматического масштабирования наклонных ионограмм (OIASA), разработанный INGV для идентификации следов наклонных ионограмм, позволяет определять максимальную используемую частоту (МПЧ) для связи между передатчиком и приемником, автоматически отклоняя ионограммы низкого качества. Тестирование алгоритма с использованием данных кампании наклонных зондирований между Дурбом (50.1 ° N, 4,6 ° E) и Рокетес (40,8 ° N, 0,5 ° E). Косые зондирования из трех различных кампаний были изучены, охватывая различные геомагнитные условия, с целью изучения поведения алгоритма автомасштабирования в спокойные и возмущенные геомагнитные периоды. Представленные результаты демонстрируют, что на производительность OIASA не влияют геомагнитные или ионосферные условия активности. Это демонстрирует удовлетворительную работу алгоритма автоматического масштабирования даже в различных геомагнитных условиях, потенциальное применение OIASA в качестве инструмента почти реального времени для целей ионосферного мониторинга и его эффективность для отслеживания ионосферных эффектов, вызванных космическими погодными явлениями.

Ключевые слова: ионосфера / наклонные ионограммы / автоматическое масштабирование / MUF

© A. Ippolito et al., Опубликовано EDP Sciences 2018

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинальная работа правильно процитировано.

1 Введение

Сбор ионосферных данных, поступающих из сетей ионозондов вертикального падения, является наиболее часто используемым методом для изучения изменчивого состояния ионосферы.Автоматическая интерпретация вертикальных ионограмм, используемая при оперативном картировании ионосферы, существует уже некоторое время. Это дает преимущество в получении информации о состоянии ионосферы в режиме реального времени. Существуют хорошо отработанные методики, позволяющие автоматически получать основные физические характеристики ионосферы из ионограммы вертикального падения. К ним относятся метод ARTIST (Reinisch & Huang, 1983; Gilbert & Huang, 1988; Galkin et al., 2008), разработанный в Массачусетском университете, Лоуэлл, США, и метод Autoscala, разработанный в «Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia» (INGV), Италия (Scotto & Pezzopane, 2002; Pezzopane & Scotto, 2007; Scotto, 2009).Такие компьютерные программы могут производить данные, которые могут быть эффективно интегрированы в модели краткосрочного и реального прогнозирования (Галкин и др., 2012). Однако информация об ионосферных параметрах строго относится к области ионосферы над рассматриваемым ионозондом, т.е. передатчик и приемник радиосигналов расположены рядом.

Косое зондирование ионосферы расширяет эту концепцию. В этом случае передатчик и приемник обычно расположены на расстоянии нескольких сотен или тысяч километров, например.грамм. Уоррингтон и Стокер (2003), Ads et al. (2015). Таким образом, приборы могут изучать распространение высокочастотных (ВЧ) радиосигналов через ионосферу в различных условиях и предоставлять оценки ионосферы между передающей и принимающей площадками. Однако интерпретация косых ионограмм значительно сложнее. Алгоритм автоматического масштабирования наклонных ионограмм (OIASA) для автоматического масштабирования наклонных ионограмм (Ippolito et al., 2015, 2016) подходит к проблеме с использованием метода максимального контраста.По наклонной ионограмме можно определить, какие частоты распространяются между заданными передающими и приемными станциями. Такая информация, относящаяся к конкретному ВЧ каналу распространения, очень важна из-за высокой изменчивости ионосферных условий, а доступные частоты для рассматриваемой радиолинии нуждаются в постоянном обновлении (Pijoan et al., 2014). Наклонные ионограммы также показывают доступные диапазоны связи и промежутки, в которых невозможно установить связь.Важным преимуществом перед вертикальным зондированием ионосферы является возможность контролировать ионосферу на больших, в противном случае недоступных расстояниях, таких как океаны (Hervás et al., 2015).

Эта работа направлена ​​на проверку и оценку эффективности OIASA (Ippolito et al., 2015) для конкретной радиолинии между Dourbes (Бельгия) и Roquetes (Испания). Это поможет программе ионосферных наблюдений и мониторинга обсерватории Эбро (OE), но также докажет ее потенциальное использование для других подобных радиолиний.Автоматическая оценка максимальной полезной частоты (МПЧ) этой радиолинии OIASA для 1-го скачка F2 анализируется для различных сезонов и ионосферных условий. Результаты сравниваются с МПЧ, измеренным экспертами-людьми, для оценки качества OIASA и оценки его способности отслеживать условия изменчивости ионосферы для спокойных и нарушенных условий.

2 Данные

OE использует ионозонд DPS4D (EB040; 40,8 ° N, 0,5 ° E) для мониторинга ионосферы и исследовательских целей (Reinisch et al., 2009). В рамках операции мониторинга ионосферы OE их DPS4D выполняет измерения ионограммы вертикального падения (VI) каждые 5 минут. В ионограммах DPS4D OE используется метод уменьшения внутриполосных радиочастотных помех и метод точного определения дальности h ‘( f ) (Reinisch et al., 2008). Это позволяет сократить время работы ионограммы до нескольких секунд при передаче малой мощности и с точностью лучше 1 км. DPS4D запускает новое программное обеспечение для автомасштабирования ионограмм ARTIST-5 (Галкин и др., 2008), который предоставляет в реальном времени необходимые данные для ассимиляции в ионосферных моделях (Галкин и др., 2012), особенно в модели IRI (Билица и др., 2017). OE DPS4D работает по тому же расписанию и программам, что и другие европейские DPS4D. Это позволяет собирать собственные эхо-сигналы VI, а также сигналы наклонного падения (OI) от соседних станций. На рисунке 1 показаны два примера ионограмм, записанных в OE с сигналом OI, передаваемым DPS4D в Дурбе, Бельгия (DB049; 50,1 ° N, 4,6 ° E).На рис. 1 (слева) показаны следы, зарегистрированные с помощью зондирования VI, соответствующие слоям ионосферы E, Es, F1 и F2 на дневных ионограммах, а также оценочный профиль электронной плотности. На рисунке 1 слева также показаны трассы OI, и на нем наблюдаются односкачковые эхо-сигналы слоев E, Es, F1 и F2. На рис. 1b показана типичная ночная ионограмма, на которой присутствует только F-область. Обратите внимание, что ионограммы различают обыкновенный (О) и необыкновенный (рентгеновский) лучи. В нормальном режиме работы зондирования OE VI различают два графика: дневной (DT) и ночной (NT).Ионограммы DT сканируют частоты от 1,0 МГц до 15,6 МГц с шагом 50 кГц, тогда как ионограммы NT сканируют от 1,0 МГц до 11 МГц с шагом 50 кГц. Ионограммы DT и NT программируются в соответствии с текущими сезонными условиями, периодически изменяя настройки времени DT и NT в соответствии с продолжительностью дня; т.е. ионограммы зимнего DT (NT) проходят с 7:30 до 16:30 UT (с 16:30 до 7:30 UT), а ионограммы летнего DT (NT) — с 6:15 до 22:00 UT (с 22:00 до 7:30 UT). 6:15 UT).

Сигналы

VI на ионограммах предоставляют информацию об ионосферных характеристиках над местом измерения.Сигналы OI на ионограммах могут предоставить информацию об ионосферных характеристиках в области отражения радиолинии между удаленными пунктами. Однако большая ширина луча передающей антенны DPS4D означает, что DPS4D обычно испускает несколько лучей, которые могут распространяться к приемнику с использованием различных ионосферных режимов распространения; например 1F2 (т. Е. Отражение от уровня F2 с одним скачком), 2F2, 1F1, 1E, 2E, 1Es и т. Д. Принимая во внимание сигнал OI для однократного распространения и то, что сигнал OI отражается посередине между передачей (Tx) и приемом ( Rx), можно оценить ионосферные характеристики, используя простую формулировку (Breit & Tuve, 1926).Таким образом, анализируя сигналы OI, передаваемые в Dourbes (Tx) и принимаемые в Roquetes (Rx), можно оценить ионосферные характеристики в центре Франции, то есть недалеко от Saint-Exupéry-les-Roches (45,5 ° N, 3,4 ° E). .

До некоторой степени легко отличить сигналы OI от сигналов VI на ионограммах EB040 в спокойных условиях ионосферы; т.е. когда развиты только регулярные слои ионосферы (рис. 2а, д, е). Последнее также возможно для ионограмм с наличием спорадических эхо-сигналов E-слоя, если они не скрываются или не перекрываются с эхо-сигналами верхних слоев (рис.2б). Однако более сложной задачей является различение сигналов OI в возмущенных ионосферных условиях и, следовательно, оценка реалистичной МПЧ. Такое нарушенное состояние может быть результатом наличия сильных спорадических E, которые скрывают сигналы верхних слоев или чьи мульти-Es моды могут перекрывать эхо-сигналы слоя OI F2 (рис. 2c, i). Геомагнитные бури также могут усложнить задачу из-за как отрицательных, так и положительных ионосферных эффектов. Отрицательные ионосферные бури могут привести к состоянию G, когда плотность слоя F1 больше, чем плотность слоя F2, и неверно интерпретировать реальный сигнал 1F2, который мы обнаруживаем (рис.2г). Отрицательные штормы могут привести к наложению эхо-сигнала OI и эха VI, если отрицательный ионосферный эффект достаточно велик в точке отражения по сравнению с эффектом в месте приема (рис. 2h). Положительные ионосферные эффекты также могут мешать автоматической оценке МПЧ, особенно когда такие эффекты достаточно значительны, что заставляет эхо-сигналы выходить за пределы сканирования ионограммы (рис. 2d), что делает невозможным измерение МПЧ. Ионосферные бури могут привести к дополнительной стратификации ионосферы (рис.2j), что создает дополнительные трудности для интерпретации сигналов OI. Другие эффекты могут быть вызваны ионосферными неоднородностями, такими как проходящие ионосферные возмущения (ПИВ), которые могут происходить из разных источников (Hocke & Schlegel, 1996), и среди них они могут быть запущены из областей полярных сияний в периоды геомагнитных возмущений (Prölss & Očko, 2000). ПИВ, наблюдаемые в эхо-сигналах VI, вызывают расщепление сигнала (рис. 2k) и форму скакательного сустава (рис. 2l) на трассах ионограммы, которые могут быть ошибочно интерпретированы как дополнительная ионосферная стратификация в трассах сигнала OI.

Был проведен систематический анализ ионосферных сигналов OI, записанных на ионограммах EB040. Эти ионограммы содержат сигналы OI, распространяющиеся по радиолинии длиной примерно 1080 км и синхронизированные с передатчиком в Дурбе (DB049). Алгоритм OIASA (Ippolito et al., 2015) был применен к вышеупомянутым ионограммам для оценки МПЧ для скачка 1-F2 радиолинии для более 1485 ионограмм. Ионограммы были записаны в различных сезонных, местных условиях и условиях геомагнитной активности.Результаты MUF, оцененные OIASA, сравниваются с MUF, измеренными экспертами-людьми, и подтверждают правильность OIASA при оценке MUF.

3 Методология: алгоритм OIASA для автоматического масштабирования наклонных ионограмм

Алгоритм OIASA (Ippolito et al., 2015, 2016) для автоматического масштабирования наклонных ионограмм приближает проблему распознавания следов наклонных ионограмм, используя метод максимального контраста. В качестве первого шага были проанализированы файлы строковых данных зондирования ионосферы, произведенные EB040, и ионограммы были сохранены в матричной форме, имеющей m строк и n столбцов, как определено следующими формулами:
(1)
а также
(2) t _f и t ₀ в уравнении (1) относятся соответственно к верхнему и нижнему пределу времени измерения записанных ионограмм, а Δ _t относится к временному разрешению измерения.Обратите внимание, что вертикальная ось на ионограммах ( y — ось на рис.1) дает виртуальную высоту h ′ ( f ) = ( c τ ( f )) / 2, где c — скорость света в свободном пространстве, а τ — время пролета радиоимпульсов. f _f и f ₀ , в уравнении (2) — конечная и начальная частоты, сканированные при измерении ионограммы, соответственно, а Δ _f относится к грубому шагу частоты измерения ионограммы.Как правило, t ₀ и Δ _t являются фиксированными значениями в зависимости от конструкции ионозонда. На рисунке 3 в качестве примера показана ионограмма, зарегистрированная 21.09.2016 в 18:05 по всемирному времени. Панель (a) представляет собой график файла данных ионограммы, предоставленного EB040 DPS4D, а панель (b) относится к матричному представлению той же ионограммы, но в соответствии с уравнениями (1) и (2).

В алгоритме OIASA две ветви параболы, s _or и s _ext , определены эмпирически, чтобы соответствовать типичным формам обычных и необычных следов наклонной ионограммы, полученной в результате однократного отражения в область F2.Каждая ветвь параболы определяется набором пар целых чисел t , f , где t связано со временем, прошедшим между передачей и приемом, а f связано с частотой сигнала. Аналитические уравнения этих кривых:
(3)
(4)
для обыкновенного и необычного следа косой ионограммы соответственно.

Коэффициенты A _ord , B _ord и C _ord вычисляются с требованием, чтобы парабола имела вершину в ( f _{v_ord} , t v_ord) , а ширина в f _{v_ord} — δ f _{_ or} равна δt _{_ or} .Это достигается установкой:
(5а)
(5b)
(5c)

Необходимо рассматривать только пары целых чисел ( f _{_ord} , t _{_ or} ) (и ( f_ _ext , t_ _ext )), потому что точка P ≡ ( f _{_ord} , t _{_ord} ) (и P ≡ ( f_ _ext , t_ _ext )) должны сравниваться с элементами матрицы, представляющей ионограмма.В уравнениях (3) и (4) t изменяется в пределах интервала [ t_ _{ord_min} , t_ _{ord_max} ]. Пределы t_ _or _ _min и t_ _ord _ _max выбраны таким образом, что f лежит в следующих пределах: f _v _ _ord −δf_ _ord ≤ f ≤ f _v _ _or для обычного следа и f _v _ _ext −δf_ _ext ≤ f ≤ _{_ доб.} за необычный след.

В этих выражениях f _v _ _ord и t _v _ _ord ( f _v _ _ext и t _v _ _ext ) 6 координаты вершины параболы, соответствующей обыкновенному (необыкновенному) следу. δf_ _or ( δf_ _ext ) представляет собой диапазон f , в котором вычисляется парабола, подходящая для обычной (необычной) трассы. δt_ _or ( δt_ _ext ) представляют собой половину ширины параболы, соответствующей абсциссе f _v _ _or — δf _ _ord 9 _ _доб — δf _ _доб ).

Кривые s _or и s _ext скользят по ионограмме, f _{v _ or} , таким образом, изменяется от δf _{_ или 9114 n — Δ f or — ext , а t v _ or варьируется от δ t _}

4 or до , и m и n определены (1) и (2).

Δ f _{ord − ext} — фиксированное значение, учитывающее обычное и необычное магнитоионное расщепление частот, которое связано с гирочастотой fb , связанной с рассматриваемой радиосвязью: Δ f _{ord − ext} = int [0,5 · fb / Δ f ].

Аналогичный диапазон изменения определен для f _{v _ ext} и t _{v _ ext} .Кроме того, изменение параметров A, B и C в уравнениях (3) и (4), что приводит к изменению формы s _или и s _ext , сохраняя при этом согласованность с типичной формой наклонной кривой ионограммы , приводит к перемещению кривых по ионограмме. Эта процедура описана Ippolito et al. (2015). Таким образом, для каждой пары кривых локальный контраст C ( f _{v_ord} , δf _{_ or} , t _{v _ ord} , δt δt , δt _{_ или} , f _{v _ внешн.} , δf _{_ внешн.} ) с записанными следами ионограммы рассчитывается как C = C _или + C _ext с учетом как количества совпадающих точек, так и их амплитуды.Обратите внимание, что f _{v _ ext} не является независимым, поскольку он связан с f _{v _ or} при условии f _{v _ ext f46 v _ or + Δ f or — ext . При этом принимаются постоянными δf _ ord = 30 и δf _ ext = 30.Алгоритм вычисления C аналогичен алгоритму, используемому Autoscala для обнаружения следа слоя F2 на вертикальных ионограммах, и основан на сумме отдельных контрастных элементов ( SEC ) в соответствии со следующими (6a) и ( 6б):
(6а)
(6b)}

SEC определяется выражением (6) в Cesaroni et al. (2013).

Пара эмпирических кривых s _ord и s _ext , характеризующаяся максимальным значением C , называемая C _max , затем выбирается как репрезентативная для формы трасс рассматриваемого наклонного ионограмма.МПЧ для конкретной рассматриваемой ионограммы выводится из вершины параболы s _или , V _или , координат ( f _{v _ or} , t _{v _ или} ). Следовательно, МПЧ — это частота, связанная с f _{v _ или} = int [( МПЧ — f _o ) / Δ f ]. Метод контраста, используемый здесь для расчета корреляции между эмпирическими кривыми и элементами матрицы, составляющими наклонную ионограмму, также обеспечивает критерий для исключения ионограмм, в которых отсутствует достаточная информация.Действительно, только если C _max больше фиксированного порога C _t , результирующие кривые считаются репрезентативными для трасс данного наклонного зондирования. В противном случае считается, что на ионограмме недостаточно информации, и ее отбрасывают. В этом случае на выходе значение MUF не предоставляется.

4 Результаты применения алгоритма OIASA к косому зондированию OE

Алгоритм автоматического масштабирования OIASA был применен к 1485 наклонным ионограммам, полученным OE для радиолинии протяженностью 1058 км между станциями Рокетес (EB040) и Дурб (DB049). Были рассмотрены три разных периода, чтобы охватить разные геомагнитные условия и изучить поведение алгоритма как для спокойных, так и для возмущенных ионосферных условий.Были изучены 576 часовых ионограмм из кампании наклонного зондирования ионосферы с 02.05.2015 по 24.05.2015, 549 часовых ионограмм из кампании, проведенной с 26.09.2015 по 18.10.2015, и 360 часовых ионограмм. наклонные ионограммы, полученные каждые два часа в течение сентября 2016 г. Результаты OIASA сравниваются с интерпретацией МПЧ опытным оператором. Процедура автоматического масштабирования наклонных ионограмм, выполняемая OIASA, основана на методе распознавания изображений. Вот почему становится критически важным изолировать следы наклонного зондирования от остальной информации, содержащейся на ионограммах оригинального оборудования.

Чтобы отфильтровать нежелательную информацию, мы отбрасываем все сигналы от эхо-сигналов с виртуальной высотой ( h ‘) ниже 500 км. Обратите внимание, что получение эхо-сигналов области F с таким h ‘ маловероятно из-за геометрии радиолинии, потому что ожидаемое h’ для 1-скачкового отражения в F-области для этой конкретной радиолинии больше чем 550 км. Мы также используем информацию о зенитном угле радиосигналов, принимаемых DPS4D в OE, и отфильтровываем все эхо-сигналы, полученные с зенитным углом ниже 30 °.Таким образом, мы удаляем предполагаемые «почти вертикальные» эхо-сигналы и фокусируемся на сигналах ионограммы со значительным наклонным углом прихода на объект OE DPS4D. Обратите внимание, что ожидаемый зенитный угол прихода ( ϑ ) для односкачкового отражения в F-области для этой конкретной радиолинии составляет около 50 градусов или больше. На рисунке 4а показан пример матричного представления ионограммы, записанной 21.09.2016 в 18:05 UT, после применения описанного выше процесса фильтрации. Кроме того, мы применяем алгоритм, описанный Ippolito et al.(2015, 2016) для фильтрации шума изображения, что приводит к более четкому изображению матричного представления той же ионограммы (рис. 4b).

После описанных выше процессов фильтрации ионограммы OIASA вычисляет локальную корреляцию C ( f _{v _ or} , δ _{f _ ord}

46, t 946 _{_ или} , δ _{t _ or} , f _{v _ внешн. v _ ext} , δ _{t_ext} ) для каждой пары кривых S _или и S _ext с записанной ионограммой.Наконец, OIASA выбирает пару кривых S _или и S _ext , которые имеют максимальное значение C ( C _max ) в качестве репрезентативных кривых наклонных кривых ионограммы. На панели (b) рисунка 4 показаны кривые S _или и S _ext , рассчитанные для примера ионограммы, соответствующего наклонному зондированию, записанному 21.09.2016 в 18:05 UT.

Предварительное испытание алгоритма OIASA было проведено на базе данных 549 ионограмм, записанных DPS4D OE, чтобы оценить наилучшее значение порога контрастности C _t .Для этого было проведено несколько прогонов OIASA с разными значениями порога контрастности C _t для одного и того же набора данных ионограммы. Тест позволил установить пороговое значение C _t = 200. Это пороговое значение обеспечивает лучшую производительность при сравнении результатов с результатами, полученными при ручном масштабировании. В дальнейшем все наклонные ионограммы, автоматически масштабируемые алгоритмом OIASA, которые характеризуются значением C _max ниже, чем C _t , считаются не имеющими достаточной информации и поэтому автоматически отбрасываются.Производительность алгоритма автомасштабирования меняется в зависимости от качества анализируемых ионограмм, а ионограммы низкого качества могут быть неправильно истолкованы. Это, в свою очередь, приводит к неправильной оценке ионосферной характеристики, которая может быть причиной необоснованного поведения ассимиляционных моделей (Галкин и др., 2012). Вот почему предпочтительно отбрасывать ионограммы с плохой информацией ( C _t <200), чем давать неправильные автоматические измерения.

Чтобы отличить качество автоматических оценок OIASA, мы квалифицируем значения MUF, предоставленные алгоритмом автомасштабирования, как точные, когда значение MUF оценки OIASA отклоняется менее чем на 0.5 МГц от значения МПЧ, предоставленного оператором, приемлемо, если это значение отклоняется менее чем на 1,5 МГц от измерения МПЧ оператором, и неудовлетворительно, если оно отклоняется более чем на 1,5 МГц. Этот диапазон интервалов отклонения выбирается в соответствии с пределами, установленными стандартами URSI, как определено Piggott & Rawer (1972). Согласно этому определению «точные» дела включаются в «допустимые» дела. Этот критерий использовался для построения таблиц (1b – 5b), в которых процент приемлемого и плохого суммируется до 100%, потому что процент точных включается в процент приемлемых.

Таблица 1

Результаты автомасштабирования набора данных наклонных ионограмм из 576 ионограмм, зарегистрированных в период со 2 по 24 мая 2015 года.Точные случаи ( MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤0,5 МГц) являются подмножеством допустимых случаев (ǀ MAF10 OIS _r ǀ≤1,5 МГц).

Таблица 2

Результаты автомасштабирования набора данных наклонных ионограмм из 360 ионограмм, зарегистрированных в период с 1 сентября 2016 г. по 30 сентября 2016 г. Точные случаи (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤0.5 МГц) являются подмножеством допустимых случаев (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤1,5 МГц).

Таблица 3

Результаты автомасштабирования набора данных наклонных ионограмм из 549 ионограмм, зарегистрированных в период с 25 сентября 2015 г. по 18 октября 2015 г. Точные случаи (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤0,5 МГц) являются подмножеством допустимых случаев (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤1.5 МГц).

Таблица 4

Были зарегистрированы результаты автомасштабирования набора данных наклонных ионограмм из 24 ионограмм, зарегистрированных 7 октября 2015 г., когда Ap-индекс имел значение 74, что соответствует возмущенным геомагнитным условиям. Точные случаи (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤0,5 МГц) — это подмножество допустимых случаев (ǀ AUF 910 OIS — MUF _{Operato r} ǀ≤1.5 МГц).

Таблица 5

Были зарегистрированы результаты автомасштабирования набора данных наклонных ионограмм из 24 ионограмм, зарегистрированных 8 октября 2015 г., когда Ap-индекс имел значение 45, что соответствует возмущенным геомагнитным условиям. Точные случаи (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤0,5 МГц) — это подмножество допустимых случаев (ǀ AUF 910 OIS — MUF _{Operato r} ǀ≤1.5 МГц).

4.1 Оценка алгоритма OIASA для долгосрочной кампании наклонного зондирования

Таблицы 1a и b содержат сводку результатов заявки OIASA на 576 наклонных ионограмм, зарегистрированных в период со 2 по 24 мая 2015 г.

Эксперт-оператор масштабировал все ионограммы рассматриваемого набора данных. Ему удалось масштабировать значение МПЧ для 540 наклонных ионограмм из 576 ионограмм набора данных для этого конкретного временного интервала, и он отбросил 36 ионограмм, для которых не было идентифицировано четких следов OI.В таблице 1а сравнивается количество ионограмм, отмасштабированных и отброшенных алгоритмом OIASA, с масштабированием экспертом, показывая хорошее соответствие между ними. Действительно, для 96% ионограммы, масштабированной OIASA, оператор также смог масштабировать значение МПЧ. Однако на 4% ионограмм, масштабированных OIASA, не удалось измерить МПЧ специалистом-человеком, что можно отнести к ложной оценке МПЧ. Это означает, что возможности алгоритма автомасштабирования замечательны, а также возможности OIASA по отбрасыванию ионограмм, в которых отсутствует достаточная информация.В таблице 1b показано качество оценок масштабирования OIASA, предполагающих, что измерение человека-эксперта является истинным значением. Результаты показывают, что только 70% значений МПЧ, оцененных алгоритмом OIASA, отклоняются менее чем на 1,5 МГц от значения МПЧ, предоставленного оператором, то есть оценки МПЧ, полученные OIASA, находятся в пределах стандартов URSI. Однако следует отметить, что май характеризуется высоким содержанием слоя Es, который часто частично скрывает сигналы верхних слоев на ионограммах (например, рис. 2в, i). Следовательно, слой Es сокращает доступный частотный диапазон наклонных следов ионограммы области F со значительным сигналом, чтобы позволить методу контраста получить надежную параболу для соответствия.

Результаты сравнения улучшаются для оценок по наборам данных ионограмм, записанных в разные сезоны, когда ионограммы характеризуются меньшим присутствием слоя Es. Это видно из результатов, представленных в таблицах 2a и b, которые суммируют результаты заявки OIASA на 360 наклонных ионограмм, зарегистрированных в период с 1 по 30 сентября 2016 года.

Эксперт-оператор смог масштабировать значение МПЧ для 351 наклонной ионограммы из 360 ионограмм набора данных (на 97%) для этого конкретного интервала времени.Алгоритм OIASA смог оценить МПЧ для 326 ионограмм из 351, масштабированных оператором, обеспечивая 173 (53,0%) точности и 288 (88,3%) приемлемых оценок. Это демонстрирует очень хорошее соответствие между значениями МПЧ, оцененными OIASA, и соответствующими значениями, предоставленными оператором. Низкий процент оценок низкого качества для сентября 2016 г. по сравнению с маем 2015 г. может быть связан с тем фактом, что в сентябре наблюдается меньшее присутствие слоя Es по сравнению с маем, что, в свою очередь, приводит к лучшему качеству ионограмм для целей масштабирования.В этом случае для всех ионограмм, масштабированных OIASA, оператор смог найти значение МПЧ, и все ионограммы, отброшенные оператором, также отбрасываются алгоритмом OIASA. Ряд 25 ионограмм, более 360, были отброшены алгоритмом автомасштабирования, в то время как оператор смог найти значение МПЧ. Это можно интерпретировать как ошибку программы, но в процедуре автоматического масштабирования гораздо важнее не предоставлять неправильные значения в качестве вывода, чем отбрасывать некоторую информацию. В этом случае OIASA отбрасывает только 7% масштабируемых ионограмм, но на выходе алгоритма не было получено неправильной оценки МПЧ.

Был проанализирован третий набор данных наклонных ионограмм, содержащий 549 наклонных зондирований, зарегистрированных DPS4D в OE в каждый час дня с 26 сентября 2015 года по 18 октября 2015 года. Представлены результаты производительности OIASA по сравнению с ручным масштабированием. в таблицах 3а и б.

Как показано в таблице 3a, оператор смог масштабировать МПЧ для 491 наклонной ионограммы из 549. Алгоритм OIASA смог оценить МПЧ для 455 ионограмм из 491, масштабированных оператором, предоставив 215 (47.3%) точны и 372 (81,8%) приемлемы. Снова демонстрируется хорошая производительность алгоритма, поскольку только 18% результатов, предоставленных OIASA, можно рассматривать как низкое качество. Более низкий процент оценок низкого качества за октябрь 2015 года по сравнению с маем 2015 года может быть связан с тем, что в октябре наблюдается меньшее присутствие слоя Es по сравнению с маем, что, в свою очередь, приводит к лучшему качеству ионограмм для целей масштабирования. Однако в октябре 2015 года сообщается о большей геомагнитной активности по сравнению с сентябрем 2016 года, что может подтвердить больший процент низкокачественных оценок МПЧ за октябрь 2015 года по сравнению с сентябрем 2016 года.

4.2 Способность OIASA контролировать наклонное зондирование в условиях геомагнитных возмущений

Два дня рассматриваемого периода времени соответствуют магнитной буре, что дало возможность изучить работу алгоритма автоматического масштабирования в возмущенных геомагнитных и ионосферных условиях. Седьмое и восьмое октября 2015 г. действительно характеризуются индексом Ap, равным 74 и 45 соответственно, тогда как 7 октября индекс Dst упал ниже -110 нТл. Это означает, что интенсивная геомагнитная буря, согласно Гонсалесу и Цурутани (1987), в наши дни затронула ионосферу Земли, вызвав ионосферные возмущения над Европой.Такие нарушения можно наблюдать по тенденции индекса AI (Mielich & Bremer, 2010), предоставленного NOA на веб-странице DIAS (http://hertz2.space.noa.gr:8080/LatestDias2/loginPage.jsp). Поскольку значения индекса AI для этих дней недоступны для ионозонда Ebro, как сообщается на веб-странице DIAS, мы рассмотрели тенденцию индекса AI, связанную с двумя ионосферными станциями Рима (Италия) и Чилтона (Англия). Как описано на портале DIAS, индекс AI в диапазоне ± 25 описывает спокойную ионосферную ситуацию, ионосферные возмущенные условия характеризуются значениями AI, которые изменяются от -25 до -50 и от 25 до 50.Для AI больше 50 или ниже -50 мы находимся в крайне тревожном состоянии.

Таблицы 4a и b содержат сводку результатов масштабирования МПЧ с помощью алгоритма OIASA для 24 наклонных часовых ионограмм, записанных 7 октября 2015 года. Эти таблицы показывают очень хорошее согласие между результатами автоматического и ручного масштабирования ионограмм. записано 7 октября 2015 года. Все ионограммы, отброшенные оператором, также удаляются OIASA. Кроме того, что касается качества масштабирования, таблица 4b показывает, что 85% оценок MUF соответствуют стандартам URSI, и только 15% можно рассматривать как низкое качество.

Аналогичные хорошие результаты можно вывести из таблиц 5a и b, в которых суммированы результаты масштабирования наклонных ионограмм, записанных 8 октября 2015 года. Действительно, существует только 1 случай неправильной оценки МПЧ, и более 93% значений МПЧ, оцененных OIASA, отклоняются. менее 1,5 МГц от значения МПЧ, указанного оператором.

Результаты сравнения автоматического масштабирования и ручного масштабирования ионограмм, записанных 7 и 8 октября 2015 г., представлены на рисунке 5.Видно хорошее соответствие между значениями МПЧ, оцененными OIASA, и значениями, измеренными человеком-оператором. Планки погрешностей указывают диапазон ± 1,5 МГц в соответствии со стандартами URSI. Черная линия на нижней панели рисунка 5 представляет средние ручные значения МПЧ с учетом недели до и недели после двух дней ионосферных возмущений. На верхней панели того же рисунка показан тренд индекса AI над двумя ионосферными станциями Рима и Чилтона для рассматриваемого временного интервала.Можно ясно видеть, как многие из нарушенных часов соответствуют ряду ионограмм плохого качества, которые отбрасываются как OIASA, так и оператором, что означает, что невозможно измерить МПЧ. Обратите внимание, что для временного интервала с измерениями и когда индекс AI указывает на ионосферные возмущения, отрицательный эффект наблюдается как в МПЧ, измеренном оператором, так и в оценках OIASA. Это доказывает возможность мониторинга ионосферных эффектов, вызванных геомагнитными возмущениями, с помощью алгоритма OIASA и возможность использования его в качестве инструмента почти реального времени для целей мониторинга ионосферы.Отчетливо прослеживается соответствие между отсутствием масштабированных ионограмм и основными возмущенными часами рассматриваемых дней. Кроме того, стоит отметить хорошее согласие между оценками МПЧ OIASA и измерениями оператора, а также исключение ионограмм, записанных в наиболее возмущенные часы.

5 Резюме и выводы

Алгоритм INGV OIASA для автоматического масштабирования следов наклонной ионограммы был применен к трем различным наборам данных наклонных ионограмм, записанных ионосферным зондом DPS4D OE (EB040), Испания. Косой сигнал на ионограммах EB040 передается от DPS4D в Дурбе (DB049), который расположен в 1080 км к северо-востоку от EB040. Оба ионосферных эхолота EB040 и DB049 работают в синхронизированных режимах для целей мониторинга ионосферы.Всего было проанализировано 1485 наклонных зондирований, и был применен алгоритм OIASA для автоматического масштабирования МПЧ F-области с одним скачком. Наборы данных охватывают различные сезонные и геомагнитные условия активности, и анализ позволил оценить эффективность OIASA для мониторинга ионосферных характеристик с помощью радиозондирования наклонного падения.

Результаты анализа, выполненного алгоритмом OIASA для трех разных сезонов, подтверждают способность OIASA автоматически оценивать МПЧ по наклонным ионограммам в процентах, очень похожих на те, которые получены оператором.OIASA смог автоматически масштабировать 536 из 540 (99,3%) наклонных ионограмм, масштабированных экспертом-человеком для кампании в мае 2015 г., и 326 из 351 (92,9%) и 455 из 491 (92,7%) за сентябрь 2016 г. и октябрь 2015 г. кампании соответственно. Эти результаты показывают способность OIASA масштабировать ионограммы с достаточной информацией. Более того, OIASA смог автоматически отклонить 14 из 38 (36,8%) наклонных ионограмм, отклоненных экспертом-человеком для кампании в мае 2015 г., и 9 из 9 (100%) и 51 из 58 (87.9%) для кампаний сентября 2016 г. и октября 2015 г. соответственно. Эти результаты также подтверждают возможности алгоритма OIASA по отказу от масштабирования ионограмм, не имеющих достаточной информации, аналогично немасштабированным ионограммам, сделанным экспертом-человеком. Качество МПЧ, оцененное OIASA, зависит от качества сигнала анализируемых ионограмм, которое во многом зависит от наличия слоев Es. Действительно, слои Es могут частично или полностью скрывать сигналы эхо-сигналов F-области (рис. 2c, i), что затрудняет поиску OIASA достаточного количества точек на ионограмме для хорошей подгонки параболы и, следовательно, хорошей оценки МПЧ.

Набор данных за май 2015 г., характеризующийся высокой встречаемостью слоя Es, дает 31% точную оценку, 69% приемлемую и 31% плохую оценку MUF OIASA. Лучшее качество получено для набора данных за сентябрь 2016 г., который характеризовался низким уровнем встречаемости слоев Es, и результаты которого показывают 53% точности, 88% приемлемости и 12% плохой оценки МПЧ. Наконец, набор данных, проанализированный за октябрь 2015 года, характеризовался отчетом о распространении слоя с низким Es с точностью 47%, приемлемой на 82% и плохой оценкой МПЧ на 18%.Следует также отметить, что OIASA может дать 4% неверной оценки МПЧ в зависимости от качества ионограмм.

Мы также оценили эффективность алгоритма OIASA для правильной оценки влияния геомагнитных бурь на ионосферные вариации. Геомагнитные бури могут вызывать отрицательные или положительные ионосферные эффекты, поднимать слой F2 (например, Blanch & Altadill, 2012; Blanch et al., 2013) и / или запускать TID. Отрицательные ионосферные эффекты могут привести к снижению МПЧ для 1F2 по сравнению с 1E или 1F1 (рис.2g, h), положительные эффекты могут привести к появлению наклонных сигналов, выходящих за пределы ионограммы (рис. 2d), а TID могут вызвать дополнительную стратификацию ионосферы, пропустить это, что приведет к тому, что OIASA не сможет оценить MUF. Мы сосредоточились на изменении МПЧ по оценке OIASA для 7–8 октября 2015 г., когда в соответствии с критериями Гонсалеса и Цурутани (1987) развивалась интенсивная геомагнитная буря, достигающая минимальных значений Dst ниже -110 нТл. Сравнение с вариацией индекса AI, который определяет условия ионосферной активности, было сделано также для этих дней, взяв за основу станции Рим и Чилтон.Тенденция индекса AI по этим станциям была проанализирована в отношении производительности автомасштабирования MUF с помощью алгоритма OIASA. Результаты, представленные в таблицах 4 и 5, ясно показывают, что процент оценки МПЧ очень хорошо сравнивается с тем, который был измерен человеком-оператором, а качество автоматического масштабирования (более 50% точной и более 80% приемлемой оценки МПЧ) аналогично оценке МПЧ. производительность в тихие промежутки времени (Табл. 2). Кроме того, из результатов видно очень хорошее соответствие между значениями МПЧ, предоставленными программным обеспечением, и значениями, предоставленными оператором.OIASA может также отслеживать отрицательное влияние на оценки МПЧ в течение большей части времени с возмущенными ионосферными условиями (рис. 6).

Наконец, стоит отметить, что, поскольку ионограммы Ebro содержат трассы как вертикального, так и наклонного зондирования, трудно полностью отфильтровать информацию, относящуюся к сигналу наклонного падения, из сигнала вертикального падения (рис. 3). Это может вызвать некоторый шум, который повлияет на автоматическое масштабирование наклонных следов изображения.Следовательно, производительность OIASA, вероятно, улучшится, если его применить к ионограммам, имеющим только наклонные следы.

В совокупности мы можем заключить, что алгоритм OIASA является подходящим инструментом для автоматического масштабирования МПЧ из ионограмм OI, а также его удобство использования в качестве инструмента почти в реальном времени для целей мониторинга ионосферы, способного отслеживать эффекты в характеристиках ионосферы, вызванные космическим пространством. погодные явления.

Благодарности

DA и EB были поддержаны проектами Universitat Ramon Llull 2016-URL-Internac-027, финансируемыми «Obra Social la Caixa», и 2017-URL-Proj-030, финансируемыми «Secretaria d’Universitats i Recerca del Departament d’Empresa i. Coneixement de la Generalitat de Catalunya ». Авторы благодарят господина Алонсо Монстазо (EA3EPH) за его помощь в масштабировании ионограмм OI. Редактор благодарит Сергея Фридмана и анонимного рецензента за помощь в оценке статьи.

Ссылки

• Ads AG, Bergadà P, Regué JR, Alsina-Pagès RM, Pijoan JL, Altadill D, Badia D, Graells S. 2015. Вертикальное и наклонное зондирование ионосферы по ВЧ-линии большой протяженности между Антарктидой и Испанией. Radio Sci 50: 916–930. DOI: 10.1002 / 2015RS005773.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Билица Д., Алтадилл Д., Трухлик В., Шубин В., Галкин И., Рейниш Б., Хуанг Х.2017. Международная справочная ионосфера 2016: от ионосферного климата до прогнозов погоды в реальном времени. Космическая погода 15: 418–429. DOI: 10.1002 / 2016SW001593.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Бланч Э, Альтадилл Д.2012. Изменение высоты пика F-области на средних широтах в ответ на условия межпланетного магнитного поля и результаты моделирования. Журнал J. Geophys Res 117: A12311. DOI: 10.1029 / 2012JA018009.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Blanch E, Marsal S, Segarra A, Torta JM, Altadill D, Curto JJ.2013. Влияние космической погоды на окружающую среду Земли, связанное с геомагнитной бурей 24–25 октября 2011 года. Космическая погода 11: 153–168. DOI: 10.1002 / swe.20035.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Breit G, Tuve MA.1926. Проверка существования проводящего слоя. Phys Rev 28: 554.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Чезарони К., Скотто К., Ипполито А.2013. Автоматический коэффициент качества для значений Autoscala foF2. Adv Space Res 51: 2316–2321. DOI: 10.1016 / j.asr.2013.02.009.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Галкин И.А., Хмыров Г.М., Козлов А.В., Рейниш Б.В., Хуанг Х, Пазнухов В.В.2008. ХУДОЖНИК 5 по радиозондированию и физике плазмы. AIP Conf Proc 974: 150–159. DOI: 10.1063 / 1.2885024.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Галкин И.А., Рейниш Б.В., Хуанг Х, Билица Д.2012. Ассимиляция данных GIRO в IRI в реальном времени. Radio Sci 47: RS0L07. DOI: 10.1029 / 2011RS004952.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Гилберт Дж. Д., Хуанг Р. В..1988. Сравнение автоматической системы масштабирования ионограмм ARTIST и стандартного ручного метода. Radio Sci 23: 968–974. DOI: 10.1029 / RS023i006p00968.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Гонсалес WD, Цурутани BT.1987. Критерии межпланетных параметров, вызывающих интенсивные магнитные бури (Dst <100 нТл). Planet Space Sci 35: 1101–1109. DOI: 10.1016 / 0032-0633 (87)

  -8.

  [НАСА ОБЪЯВЛЕНИЕ]

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Эрвас М., Альсина-Пагес Р.М., Орга Ф., Альтадилл Д., Пихоан Д.Л., Бадиа Д.2015. Узкополосное и широкополосное канальное зондирование ионосферной радиолинии между Антарктикой и Испанией. Remote Sens 7: 11712–11730. DOI: 10.3390 / rs702.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Хокке К., Шлегель К.1996. Обзор атмосферных гравитационных волн и бегущих ионосферных возмущений: 1982–1995. Энн Геофис 14: 917–940. DOI: 10.1007 / s00585-996-0917-6.

  [Google ученый]

• Ипполито А., Скотто К., Фрэнсис М., Сеттими А., Чезарони С. 2015.Автоматическая интерпретация косых ионограмм. Adv Space Res 55: 1624–1629.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Ипполито А., Скотто К., Саббаг Д., Сгринья В., Махер П.2016. Методика повышения надежности алгоритма автоматического масштабирования косых ионограмм. Radio Sci 51: 454–460. DOI: 10.1002 / 2015RS005919.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Милих Дж., Бремер Дж.2010. Модифицированный индекс для описания краткосрочной и долгосрочной активности ионосферы. Энн Геофис 28: 2227–2236. DOI: 10.5194 / angeo-28-2227-2010.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Пеццопане М., Скотто К.2007. Автоматическое масштабирование критической частоты foF2 и MUF (3000) F2: сравнение Autoscala и ARTIST 4.5 по римским данным. Radio Sci 42: RS4003. DOI: 10.1029 / 2006RS003581.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Пигготт WR, Rawer K, U.R.S.I. Справочник по интерпретации и обработке ионограмм, Принятый U.R.S.I. Комиссия III, Варшава, Польша, 1972 г.

  [Google ученый]

• Пиджоан Дж. Л., Алтадилл Д., Торта Дж. М., Альсина-Пагес Р. М., Марсал С., Бадиа Д. 2014. Удаленная геофизическая обсерватория в Антарктиде с передачей данных HF: обзор.Remote Sens 6: 7233–7259. DOI: 10.3390 / rs6087233.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Прёльс Г.В., Очко М.2000. Распространение штормовых эффектов в верхних слоях атмосферы на более низкие широты. Adv Space Res 26: 131–135. DOI: 10.1016 / S0273-1177 (99) 01039-X.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Рейниш Б.В., Хуанг Х.1983. Автоматический расчет профилей электронной плотности по цифровым ионограммам: 3. Обработка донных ионограмм. Radio Sci 18: 477–492. DOI: 10.1029 / RS018i003p00477.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Рейниш Б.В., Пазнухов В.В., Галкин И.А., Альтадилл Д., МакЭлрой Дж.2008. Точные радиолокационные измерения дальности с дигизондами в радиозондировании и физике плазмы. AIP Conf Proc 974: 144–149. DOI: 10.1063 / 1.2885022.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Рейниш Б.В., Галкин И.А., Хмыров Г.М., Козлов А.В., Библ К., Лисысян И.А., Чейни Г.П., Хуанг Х, Китроссер Д.Ф., Пазнухов В.В., Ло Й., Джонс В., Стельмаш С., Хамель Р., Грочмал Дж.2009. Новый дигизонд для приложений исследования и мониторинга. Radio Sci 44: RS0A24. DOI: 10.1029 / 2008RS004115.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Скотто К.2009. Методика расчета профиля электронной плотности для анализа ионограмм Autoscala. Adv Space Res 44: 756–766. DOI: 10.1016 / j.asr.2009.04.037.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

• Скотто К., Пеццопане М.2002. Программа для автоматического масштабирования foF2 и MUF (3000) F2 по ионограммам. В: Proceedings of URSI 2002, Маастрихт, 17-24 августа 2002 г. http://www.ursi.org/proceedings/procGA02/papers/p1018.pdf.

  [Google ученый]

• Уоррингтон Э.М., Стокер А.Дж.2003. Измерения доплеровского и многолучевого распространения ВЧ-сигналов проходят по трассе, ориентированной вдоль впадины средних широт. Radio Sci 38: 1080. DOI: 10.1029 / 2002RS002815.

  [CrossRef]

  [Google ученый]

Цитируйте эту статью как : Ippolito A, Altadill D, Scotto C, Blanch E.2018. Алгоритм автоматического масштабирования наклонных ионограмм Применение OIASA к ионограммам, зарегистрированным ионозондом обсерватории Эбро. J. Космическая погода Космический климат. 8 : A10

Все таблицы

Таблица 1

Результаты автомасштабирования набора данных наклонных ионограмм из 576 ионограмм, зарегистрированных в период со 2 мая 2015 г. по 24 мая 2015 г. Точные случаи (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤0.5 МГц) являются подмножеством допустимых случаев ( MUF _{OISA —} MUF _{Operato r} ǀ≤1,5 МГц).

Таблица 2

Результаты автомасштабирования набора данных наклонных ионограмм из 360 ионограмм, зарегистрированных в период с 1 сентября 2016 г. по 30 сентября 2016 г. Точные случаи (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤0,5 МГц) являются подмножеством допустимых случаев (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤1.5 МГц).

Таблица 3

Результаты автомасштабирования набора данных наклонных ионограмм из 549 ионограмм, зарегистрированных в период с 25 сентября 2015 г. по 18 октября 2015 г. Точные случаи (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤0,5 МГц) являются подмножеством допустимых случаев (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤1,5 МГц).

Таблица 4

Были зарегистрированы результаты автомасштабирования набора данных наклонных ионограмм из 24 ионограмм, зарегистрированных 7 октября 2015 г., когда Ap-индекс имел значение 74, что соответствует возмущенным геомагнитным условиям.Точные случаи (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤0,5 МГц) — это подмножество допустимых случаев (ǀ AUF 910 OIS — MUF _{Operato r} ǀ≤1,5 МГц).

Таблица 5

Были зарегистрированы результаты автомасштабирования набора данных наклонных ионограмм из 24 ионограмм, зарегистрированных 8 октября 2015 г., когда Ap-индекс имел значение 45, что соответствует возмущенным геомагнитным условиям.Точные случаи (ǀ MUF _{OIS A} — MUF _{Operato r} ǀ≤0,5 МГц) — это подмножество допустимых случаев (ǀ AUF 910 OIS — MUF _{Operato r} ǀ≤1,5 МГц).

Все фигуры

Вовлекает ли косая / наклонная перспектива во время виртуальной навигации как эгоцентрическую, так и аллоцентрическую стратегии мозга?

Целью этого исследования было определить, как активность мозга различается во время кодирования пространственной информации в маршрутах, наклонной и перспективной навигации в виртуальном городе, и какие нейронные структуры задействованы, когда испытуемые должны придумать ярлык и перейти к нему с помощью эти три разные точки зрения.

Поведенческие результаты

Первый важный результат нашего исследования подтверждает сложность поиска кратчайшего пути после кодирования перспективы маршрута, а также преимущество обзора и наклонной перспективы в сравнении. Действительно, эффективность поиска кратчайшего пути в условиях маршрута была ниже, чем в условиях наклонного маршрута и съемки. Информация, предоставленная испытуемым, повлияла на тип стратегии, которую они могли использовать для достижения успеха в решении задачи. Информация о маршруте — это одномерное представление последовательности ориентиров и связанных поворотов на пути, в то время как геодезические знания предоставляют информацию о пространственных отношениях между ориентирами, включая ориентацию и расстояния.Информация об исследовании, полученная как при наклонной, так и при съемке, может включать относительную информацию об ориентирах или участках дороги, между которыми никогда не было прямого перемещения. Способность находить новые ярлыки между двумя точками считается характеристикой знаний обследований [1], [33] — [35], и сложность поиска ярлыка после кодирования с перспективой маршрута может быть истолкована как отражающая сложность разработки эффективная стратегия поиска ярлыков с использованием только грубых и, возможно, неметрических пространственных данных, полученных из кодирования с перспективой маршрута.

Второй интересный результат заключается в том, что, как мы и предполагали, испытуемые лучше всего справлялись с поиском ярлыков в наклонных и обзорных видах (около 85%). Эти результаты продемонстрировали, что наклонная перспектива приводит к точным характеристикам, близким к тому, что наблюдалось при съемке. На поведенческом уровне наклонная перспектива могла предоставить информацию, необходимую для выработки эффективной стратегии, которая, вероятно, будет закрыта для исследовательской.

Третий результат заключается в том, что мы наблюдали явный гендерный эффект, как предсказывалось ранее [9], [21] — [25], когда мужчины превосходили женщин по нескольким параметрам.У мужчин было на 10% больше успешных сокращений, чем у женщин, которые с большей вероятностью либо не находили ярлык до установленного срока (50 с), либо отказывались от испытания из-за пространственной дезориентации. Мужчины также выполняли свои короткие пути быстрее, чем женщины, хотя качество мужских и женских сокращений было одинаковым с точки зрения пройденного расстояния. Эти результаты показывают, что мужчины были более уверены в себе, чем женщины, во время задачи по поиску ярлыков (меньше колебаний на перекрестках), что позволяет предположить, что мужчины могут строить более эффективные когнитивные карты, чем женщины.

Активация мозга

Когда были объединены средние значения активаций для всех субъектов и различных задач, сравнение активности мозга в условиях наклонной и перспективной перспективы не показало значительных различий. Это подтвердило поведенческие данные, которые предполагают, что обзор и наклонные точки зрения примерно одинаково полезны для кодирования пути и поиска ярлыков.

Однако тот же анализ показал, что перспектива маршрута задействовала области, которые не были активированы обзором или наклонной перспективой, включая парагиппокампальную извилину и медиальную затылочно-теменную кору.Участие парагиппокампа в обнаружении экологических ориентиров во время навигации было предложено Гахемом и др. [13] и Меллетом и др. [14] и с тех пор широко задокументировано. Было показано, что парагиппокампальная извилина активна в кодировании окружающей среды, когда присутствуют заметные ориентиры, но не когда ориентиры отсутствуют [36]. Возможное объяснение состоит в том, что в настоящем исследовании ориентиры использовались в условиях перспективы маршрута, но не в условиях наклонной перспективы и перспективы съемки, для кодирования окружающей среды и поиска ярлыков.Это также согласуется с двусторонними активациями парагиппокампа, о которых сообщалось во время мысленного вызова выдающихся ориентиров [37]. Также было показано, что кора парагиппокампа задействована во время пассивного наблюдения за локальной средой по сравнению с пассивным наблюдением за объектами [7]. Точно так же было обнаружено, что эти области участвуют в восстановлении пространственных отношений между объектами [38], [39]. Наконец, участие парагиппокампа также было обнаружено в эгоцентрической и аллоцентрической оценке расстояния [16] и в процессе запоминания цели в лабиринте виртуальной реальности [19].Foo et al. [29] предположили, что грубые, возможно неметрические, пространственные знания могут быть получены с точки зрения маршрута, но что они ограничены разрешающей способностью и предвзятостью системы интеграции путей человека. Соответственно, мы предполагаем, что перспектива маршрута предъявляет более высокие требования к процессам вывода глобальных свойств из доступных локальных свойств, чем обзор или наклонные перспективы. Вовлечение парагиппокампа, с этой точки зрения, отражает уверенность в выводе возможных сокращений на пространственные отношения между ориентирами, извлеченными во время пути.Этот процесс в основном потребуется в состоянии перспективы маршрута, поскольку в этом случае не предоставляется общая схема окружения. Напротив, когда информация о типе съемки предоставляется в условиях наклонной и перспективной съемки, эта информация, подобная карте, может использоваться непосредственно для вывода точных сокращений.

Анализ процентного изменения сигнала, выполненный в областях интереса, значительно активированных во взаимодействии между перспективой и задачей, подтвердил нашу гипотезу о том, что наклонная перспектива, по сути, функционирует как гибрид маршрута и перспективы обзора.Действительно, общие изменения активности мозга наблюдались между наклонной и обзорной перспективами в левой язычной извилине и левой веретенообразной извилине, в то время как другие наблюдались между маршрутом и наклонной перспективой, как в правой средней затылочной извилине во время кодирования. Гибридный характер наклонной точки зрения также подтверждается тем фактом, что изменения активности мозга, наблюдаемые во время кодирования и поиска ярлыков с этой точки зрения в правой язычной извилине, правой веретенообразной извилине и левой средней затылочной извилине, попадали между теми, которые наблюдались при использовании маршрута и перспективы обзора.

В настоящем исследовании срединные затылочно-теменные области (клин и предклинье) были активированы в условиях перспективы маршрута, а не в условиях наклонной или обзорной перспективы. Эти затылочно-теменные активации могут быть связаны с более богатыми и яркими визуальными образами [40] во время навигации по маршруту в этом состоянии, чем в условиях наклона или обзора. Недавние результаты функциональной визуализации у здоровых субъектов предполагают центральную роль предклиния в широком спектре высокоинтегрированных задач, включая зрительно-пространственные образы, извлечение эпизодической памяти и операции самообработки, а именно получение перспективы от первого лица и опыт. агентства (см. обзор [41]).Роль, которую играет предклинье, остается неясной, но его сильное участие в навигации от первого лица было недавно подтверждено нейропсихологическим исследованием [42] с участием пациентов с амнестическими легкими когнитивными нарушениями. Было обнаружено, что меньший объем правого предклиния коррелирует с худшей производительностью в виртуальном лабиринте.

Анализ изменения сигнала показал, что правая язычная извилина и левая веретенообразная извилина были активнее на маршруте, чем в условиях наклонной перспективы, и, в свою очередь, больше в наклонных, чем в условиях съемки.Лингвальная извилина является частью затылочно-височного пути, задействованного посредством распознавания и распознавания объектов. Эта активность язычной извилины может отражать распознавание ориентиров или конкретных пересечений, которые были закодированы объектно-подобным образом [43]. Маршрут и наклонная перспектива, по-видимому, в большей степени связаны с распознаванием ориентиров или перекрестков, чем с точки зрения съемки. Веретенообразная извилина также участвует в идентификации ориентиров, вероятно, посредством анализа геометрических особенностей [44].Профиль активации средней затылочной коры был относительно сложным в нашем исследовании, но также может отражать важные особенности различных перспективных состояний. Во время задачи кодирования левая средняя затылочная кора была менее активна в состоянии перспективы маршрута, чем в состоянии наклонной перспективы, и меньше активировалась в наклонной перспективе, чем в перспективе обзора. Напротив, в задаче быстрого доступа наблюдалась обратная картина с перспективой обзора, связанной с более низкой активацией средней затылочной коры, чем наклонная перспектива, что, в свою очередь, индуцировало более низкую активацию, чем перспектива маршрута.Средняя затылочная кора участвует в анализе ориентиров и ландшафтов и имеет решающее значение для независимого от точки зрения представления ориентиров [44]. В навигационных задачах считается, что эта область связана с визуальными образами и, в частности, с репетицией воображаемой информации [45]. Таким образом, Nemmi et al. [46] продемонстрировали, что активация в средней затылочной коре связана с обработкой зрительно-пространственных атрибутов воспринимаемых ориентиров и с повторением всего маршрута для обнаружения совпадений и несоответствий.Наши результаты показывают, что дифференциальная активация средней затылочной коры, язычной и веретенообразной извилины в трех перспективных условиях в зависимости от задачи может отражать зависимость от пространственных отношений между ориентирами, извлеченными во время пути в процессе определения возможных сокращений. Интересно, что наклонная и обзорная точки зрения вызывали аналогичные изменения мозга в левой язычной и веретенообразной извилинах, но диссоциировали изменения активности мозга в этих структурах в правом полушарии.

Активация левого гиппокампа, наблюдаемая в нашем исследовании, также предполагает, что эта структура может играть важную и различную роль в трех перспективных условиях. В самом деле, хотя наклонные и обзорные перспективы не вызывали дифференциальной активности в левом гиппокампе во время задачи кодирования, наклонная перспектива была связана с большей активацией левого гиппокампа, чем обзорная перспектива во время короткой задачи. Перспектива маршрута, которая вызывала самый низкий уровень активации во время кодирования, вызывала самый высокий во время задачи поиска ярлыка.Активация правого гиппокампа тесно связана с точным определением местоположений и точной навигацией между ними [36]. С другой стороны, левый гиппокамп, вероятно, участвует в непространственных аспектах навигации. В самом деле, левый гиппокамп человека может отдавать предпочтение эпизодической и, в частности, автобиографической памяти событий [47], [48]. Было обнаружено, что левый гиппокамп активируется во время восстановления автобиографических воспоминаний [47], [48], а также во время восстановления аспектов лично пережитых событий в среде виртуальной реальности [15].Активация левого гиппокампа также была отмечена в нейровизуализационных исследованиях навигации [8], [38], [43], но эта активность не коррелировала с какими-либо навигационными показателями, в отличие от активности правого гиппокампа. Это говорит о том, что левый гиппокамп может быть преимущественно (но не исключительно) вовлечен в не навигационные аспекты эпизодической памяти.

Насколько нам известно, настоящее исследование является первым исследованием структур мозга, связанных как с кодированием, так и с поиском ярлыков в виртуальной реальности.Мы заметили, что задача кодирования была конкретно связана с затылочной и двусторонней теменной активацией, в то время как задача быстрого доступа вызвала активность в большой нейронной сети, охватывающей лобную, паралимбическую, затылочную, теменную, височную корку и подкорковые области. Теменная активация во время кодирования пути ранее наблюдалась Шелтоном и Габриэли [26], которые предположили, что теменные области связаны с мысленным вращением объектов и вниманием [49], [50].

Наши результаты ясно продемонстрировали, что наклонная и обзорная точки зрения имеют общую мозговую активность в левой язычной и веретенообразной извилинах и приводят к очень схожим поведенческим характеристикам.Тем не менее, мы наблюдали, что наклонная перспектива вызывает промежуточные паттерны активации (между маршрутом и обследованием) в некоторых областях мозга, таких как правая язычная и веретенообразная извилины. Наклонная перспектива также была связана с активацией перспективы маршрута во время кодирования в правой средней затылочной извилине. Эти результаты позволяют предположить, что наклонную перспективу можно рассматривать как гибридную. Однако среди структур мозга, которые, по прогнозам, будут конкретно задействованы в маршруте или обзоре [26] — [27], мы наблюдали только активацию медиальной височной доли и угловой извилины.В этих условиях общие активации для обзора и наклонных перспектив или для маршрутизации и наклонных перспектив в основном наблюдались в структурах, которые не были специально активированы в аналогичных предыдущих исследованиях [26], [27]. Эти результаты можно объяснить характером задачи, поставленной в нашем эксперименте. Действительно, до фазы кодирования испытуемые были проинформированы о том, что они должны будут реализовать сокращенный путь после представления пути. Это условие кодирования отличалось от задачи, использованной в аналогичных предыдущих исследованиях [26], [27], в которых испытуемые должны были кодировать путь, чтобы воспроизвести его.Более того, насколько нам известно, области мозга, участвующие в навигации во время задачи поиска ярлыков, ранее не исследовались.

Задача быстрого поиска, использованная в нашем эксперименте, возможно, способствовала использованию аспектов наклонной перспективы, подобных опросу. Дальнейшее исследование, включающее пространственную задачу, которая дает преимущество перспективы маршрута, могло бы обеспечить четкую демонстрацию гибридной природы наклонной перспективы. Это обеспечило бы четкую научную поддержку выбора использования этой перспективы во многих навигационных средствах.